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分裂篩選標記慢病毒系統

背景介紹

在科研和細胞工程等領域中構建穩定表達細胞株，經常需要實現多個基因的穩定共表達，目前常用的策略是多重感染、多重分離篩選等，然而這種方式存在很多弊端：①真核細胞中可使用的篩選標記數量有限；②實驗周期長；③同時使用多個不同的篩選基因可能對細胞產生不利影響；④多基因串聯，病毒包裝效率低等；以上問題為篩選多基因共表達的穩轉株在時間和成本等方面提出了挑戰。因此，有必要開發新的技術手段解決以上問題。

維真生物建立了一種可簡單快速地實現多基因共表達的分裂篩選系統！

 將一種篩選標記分成N端和C端兩部分，分別連接內含子剪接接頭TS1和TS2，構建到兩個慢病毒載體中，然后將兩個載體進行細胞轉導，部分細胞在此過程中“一無所獲”，部分細胞會“攝取”其中一種載體，部分細胞會“攝取”兩種載體。只有當含有N端和C端篩選標記的兩個載體同時被一個細胞“攝取”時，在mRNA水平N-篩選標記和C-篩選標記才會連接成一個完整的篩選標記，從而表達完整的篩選標記蛋白。而那些沒有“攝取”到載體，或者只“攝取”到一種載體的細胞（即N端和C端篩選標記的兩個載體沒有進入一個細胞），該細胞內由于無法表達一個完整的篩選標記蛋白，從而被淘汰。

圖1. 分裂篩選標記原理示意圖

研發路線

雙載體圖譜

圖2. 慢病毒雙載體圖譜

 誘導性多能干細胞（IPS cells）是指通過基因轉染技術（gene transfection）將某些轉錄因子導入動物或人的體細胞，將終末分化的體細胞重編程為胚胎干細胞（ESC）細胞樣的多潛能細胞。現在大多是通過病毒攜帶特定的轉錄因子進入體細胞內，來獲得多能性干細胞。2006年日本京都大學Shinya Yamanaka在世界著名學術雜志《細胞》上率先報道了誘導多能干細胞的研究，他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發現可誘導其發生轉化，產生的iPS細胞在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。

 然而，目前研究人員用來產生誘導性多能干細胞的方法耗時長且效率低，當把四種轉錄因子導入成體細胞如皮膚細胞中時，利用上千個皮膚細胞最終只能獲得幾個iPSCs。因此，我們嘗試利用新建立的分裂篩選標記的慢病毒穩轉系統同時表達以上四種轉錄因子，在短時間內獲得穩轉細胞系。

首先，我們將四種轉錄因子分成兩組分別構建到前面所述的雙慢病毒載體中，得到pLent-Ef1a-Oct4-P2A-Sox2-cmv-N-Puro（簡稱IPS-N-Puro）和pLent-Ef1a-Klf4-P2A-Myc-cmv-C-Puro（簡稱IPS-C-Puro）的慢病毒質粒。隨后將這兩個慢病毒質粒共轉到293A細胞中，通過Puro篩選，觀察細胞生長情況。如下圖所示設置實驗組與對照組，我們發現在Puro加壓后空細胞組細胞大量死亡，而實驗組與對照組中細胞存活率較高。這一結果說明，有大量的雙慢病毒載體進入了同一細胞中，抗生素基因得到了正常表達，大量細胞得以存活下來。

隨后，我們對實驗組與對照組細胞中四種轉錄因子mRNA水平的表達情況進行了定量檢測，如下圖所示，我們發現實驗組細胞中四種轉錄因子的mRNA表達量都要明顯高于GFP對照組，這一結果同樣佐證了上述結論，有大量的雙慢病毒載體進入了同一細胞中，四種轉錄因子實現了高表達。

接著，我們將上述兩個慢病毒載體分別包裝成慢病毒，進行293A細胞的共感染，如下圖所示設置實驗組和對照組，感染72小時后，加Puro進行篩選，我們發現，空白組細胞（5）和單一慢病毒感染組（2、3）的細胞，出現大量死亡，而“攝取”到雙病毒的實驗組（1）和GFP組（4），細胞存活率明顯高于兩病毒單獨感染組，在篩選一周后我們成功獲得了大量穩轉株細胞。

同樣地，我們對兩病毒共感染組與GFP慢病毒對照組中細胞中的四種轉錄因子mRNA水平的表達情況進行了定量檢測，結果與質粒轉染所得結果基本一致，兩病毒共感染組細胞中四種轉錄因子的mRNA表達量都要明顯高于GFP對照組，結果同樣驗證了上述結論，四基因共表達的穩轉株細胞構建成功。

維真生物成功建立了一種可實現分裂篩選標記的慢病毒穩轉系統，能夠利用一個篩選標記選擇多個轉基因，使多基因的共同表達更加簡單方便，并且能在短時間內進行多基因的穩轉細胞系構建。目前，我們已經利用該系統成功獲得了四種轉錄因子穩定表達的誘導性多能干細胞的穩轉細胞株。此外，該系統還可以在CRISPR/Cas9基因組編輯中，用于雙轉基因或雙等位基因敲除的陽性細胞選擇。