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神經退行性疾病是一種神經系統慢性進行性損害疾病，以遠端軸突損傷和逆死性神經病變為主要特征，然而從軸突損傷到神經元死亡的途徑仍不完全清楚。基因表達的變化是神經損傷的重要表現，在體內高通量篩選轉錄因子，以確定神經元損傷或軸突再生的關鍵調控因子是研究神經退行性疾病的有效方案，CRISPR-gRNA文庫篩選結合多組學分析為實現體內大規模遺傳篩選提供了雙重保障。
文章標題：Core transcription programs controlling injury-induced neurodegeneration of retinal ganglion cells.
發表期刊：Neuron（IF=18.688）
合作客戶：哈佛醫學院
維真助力：
小鼠gRNA AAV載體庫
· 維真生物 ·
小鼠gRNA AAV載體庫
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種屬：小鼠
數量：近13000
載體：AAV
應用：可以直接用于AAV包裝，可與spCas9 AAV病毒或者spCas9轉基因動物搭配使用，輕松實現目的基因的體內基因敲除，方便目的基因的功能研究。
優勢： 1、載體GFP熒光標簽，便于監測質粒轉染效率；2、可以直接進行AAV包裝；3、與單條gRNA相比，每個目的基因4-5條gRNA pool的設計，極大增加敲除效率；4、可提供整個小鼠gRNA pool 克隆庫，也可提供各類子庫，如轉錄因子、蛋白激酶、磷酸酶、藥物靶點、膜蛋白等。5、全部現貨，大大縮短科研周期。
多數神經退行性疾病表現為相同的病理特征，其中極具破壞性的是神經元死亡，但目前神經退行性疾病中神經元死亡和軸突再生的調控程序仍知之甚少。為了確定成年個體中樞神經系統軸突損傷導致神經退行性變的機制，研究人員利用了視神經擠壓(ONC)模型，即通過切斷視網膜神經節細胞(RGC)軸突導致ONC，進而導致大量RGC死亡和再生失敗。基于CRISPR-gRNA文庫篩選技術，研究人員對1893個轉錄因子(TF)進行全基因組篩選，尋找ONC后RGC存活和軸突再生的抑制因子，同時通過ATAC-seq和RNA-seq等分析損傷RGC的表觀遺傳和轉錄情況，確定了損傷響應性TF及其靶標。研究結果揭示了從軸突損傷轉化為神經退行性疾病的核心轉錄程序，并提出了治療神經退行性疾病的新策略。
1. CRISPR-gRNA文庫篩選技術結合表觀遺傳分析篩選神經元存活和軸突再生的負調控TF
作者利用RIKEN和TFCat數據庫匯總了1893個小鼠基因組中的TF，并針對每個TF基因不同區域，從CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫中選擇了五條sgRNAs，然后pool在一起克隆至AAV2載體，建立了一個包含1893個AAV2-sgRNA的文庫（維真生物助力提供）。隨后借助AAV2將sgRNAs和Cas9引入RGC，ONC后兩周進行篩選檢測以確定調控神經元存活和軸突再生的TF。實驗結果確定了10個負調控神經元存活的TF和13個負調控軸突再生的TF。通過整合ATAC-seq，RNA-seq，TF footprinting信息篩選到4種負調控RGCs損傷存活的關鍵TF：ATF3、ATF4、C/EBPγ和CHOP。之后作者重點探究了這四個關鍵的TF調控的轉錄程序，發現ATF3/CHOP優先調節由細胞因子和先天免疫激活的通路，ATF4/C/EBPγ調節由內在神經元應激源激活的通路。
2. 受損RGC中的關鍵TF存在功能性交互作用
ATF3/CHOP和C/EBPγ/ATF4作為ONC后RGC存活和軸突再生的兩組負轉錄調控因子，作者推測與單個TF敲除相比，聯合操縱來自兩組的TF可能具有疊加效應，并進一步提高RGC的存活率。作者發現：TF的單個敲除相較于對照組顯著提高了RGC的存活率；與敲除單個TF相比，TF的交替組合敲除(ATF3/C/EBPγ, ATF3/ATF4和C/EBPγ/CHOP)顯著提高RGC存活率；但同組內共敲除TF（ATF3/CHOP 或 ATF4/C/EBPg）的保護作用并不明顯。這表明ATF3/CHOP和ATF4/C/EBPγ在神經元損傷后激活兩條平行的促死亡通路，兩通路間存在重疊和互補作用。
本研究通過獨立的體內遺傳篩選和損傷視網膜神經節細胞的多組學分析，確定了四種損傷后神經元存活的關鍵互補調控因子（ATF3、CHOP、ATF4、C/EBPγ），這些基因分別調節兩種不同的退行性程序，以應對外在和內在的壓力。
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