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『CircRNA領域新發現』浙江大學范順武教授課題組發現CircRNA :CircSERPINE2,為骨關節炎治療提供有效策略

環狀RNA（circular RNAs，CircRNAs）是一類特殊的非編碼RNA分子，不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構，具有組織特異性和高度保守性，廣泛存在于哺乳動物細胞中。與線性RNA相比，CircRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。一些CircRNAs富含miRNA結合位點，在細胞中可以作為miRNA海綿（miRNA sponge）或競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），自動隔離(li)或競(jing)爭性抑(yi)制(zhi)miRNA的(de)(de)(de)活性，進而(er)解除miRNA對其(qi)靶基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)抑(yi)制(zhi)作(zuo)用，提高靶基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達水平。最(zui)近不斷發現circRNA在不同研(yan)究(jiu)領域和研(yan)究(jiu)方向的(de)(de)(de)新(xin)功(gong)能，circRNA已成為RNA研(yan)究(jiu)領域的(de)(de)(de)最(zui)新(xin)熱點，吸引著無數科(ke)研(yan)工作(zuo)者的(de)(de)(de)目光。

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種由增齡、肥胖、勞損、創傷等諸多因素引起的退行性病變，主要特征是軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生，臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、活動受限和關節畸形等，多發于中老年人。科學家研究發現CircRNA表達水平的改變與OA發生有關，浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院范順武教授帶領的團隊在對OA研究中發現了一種新的CircRNA，（hsa_circ_0008365，命名為CircSERPINE2），CircSERPINE2過表達通過miR-1271 - ERG通路緩解軟骨細胞（HCs）凋亡及促進胞外基質（ECM）的合成代謝，在OA治療中可發揮積極作用。

研究結果

1.CircRNA在正常人體及OA患者組織中的表達

臨床OA患者(zhe)和(he)正(zheng)常人體組織(zhi)進(jin)行RNAseq分析，發現(xian)OA組CircRNA表達(da)呈現(xian)差(cha)異(yi)(yi)。RT-qPCR分析確定了25個表達(da)差(cha)異(yi)(yi)最大的(de)CircRNA及14個下(xia)調的(de)CircRNA。作(zuo)者(zhe)用白細(xi)胞介(jie)素(IL)-1β和(he)腫瘤壞死(si)因(yin)(yin)子(TNF)-α處理的(de)的(de)原發性人類軟骨細(xi)胞(HCs)試驗證實(shi)了包含hsa_circ_0008365在內(nei)的(de)六種(zhong)CircRNA在OA樣本組織(zhi)中表達(da)下(xia)調。Sanger測序法(fa)確定hsa_circ_0008365是由Serpine2基因(yin)(yin)的(de)第二(er)個至第四個外顯子環化組成(cheng)，即5’端剪(jian)(jian)接位點和(he)外顯子3’端相應位點形成(cheng)的(de)頭尾(wei)剪(jian)(jian)接，因(yin)(yin)此命名為CircSERPINE2。

OA患者和(he)正常人體(ti)軟骨細胞中CircSERPINE2的表(biao)達(da)水平(ping)檢測(ce)顯示，CircSERPINE2在(zai)OA樣本呈(cheng)表(biao)達(da)下調模式，在(zai)HCs的細胞質中大量表(biao)達(da)（圖1）。

圖1 CircSERPINE2在OA軟骨組織和細胞中的驗證和表達

2.CircSERPINE2調節軟骨細胞的凋亡和ECM代謝

為(wei)了評估CircSERPINE2參與(yu)了基(ji)(ji)質(zhi)降(jiang)(jiang)解酶的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)控，作者用CircSERPINE2小(xiao)干擾RNA轉染HCs，發現(xian)CircSERPINE2表(biao)達(da)(da)(da)下調(diao)并不影響SERPINE2的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA水(shui)平，而是(shi)增(zeng)加(jia)HCs的(de)(de)(de)(de)(de)凋亡(wang)(wang)率(lv)，CircSERPINE2的(de)(de)(de)(de)(de)過表(biao)達(da)(da)(da)可明顯(xian)抑制IL-1β誘導的(de)(de)(de)(de)(de)HCs凋亡(wang)(wang)率(lv)。WB結果(guo)顯(xian)示抑制CircSERPINE2的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)(da)增(zeng)加(jia)了MMP3、MMP13和ADAMTS4（基(ji)(ji)質(zhi)降(jiang)(jiang)解相關酶）的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)(da)，降(jiang)(jiang)低SOX9、COL2A1和aggrecan的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)(da)。IF和RT-qPCR結果(guo)再次證(zheng)實，CircSERPINE2表(biao)達(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)下調(diao)顯(xian)著影響了HCs和SW1353細(xi)胞(bao)（人骨(gu)肉瘤細(xi)胞(bao)）中(zhong)MMP13、ADAMTS4、COL2A1和aggrecan的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)(da)(da)水(shui)平，CircSERPINE2的(de)(de)(de)(de)(de)下調(diao)促進了HCs和SW1353細(xi)胞(bao)凋亡(wang)(wang)和代(dai)謝過程（圖(tu)2）。

圖2 CircSERPINE2表達下調誘導軟骨細胞基質降解酶的表達

3.CircSERPINE2是miRNAs的吸附海綿

研究發現OA組織中(zhong)有191個miRNA表(biao)達(da)上調，CircSERPINE2可下調miR-1271和miR-93的(de)(de)(de)表(biao)達(da)。WB結(jie)果顯(xian)示(shi)miR-1271與基質降解和合成蛋白的(de)(de)(de)表(biao)達(da)有關(guan)，而miR-1271在(zai)10個OA樣本軟骨中(zhong)表(biao)達(da)上調。熒光素酶檢(jian)測和FISH實驗(yan)證(zheng)實CircSERPINE2與miR-1271結(jie)合。miR-1271過(guo)表(biao)達(da)的(de)(de)(de)細胞凋亡率升高，伴隨MMP3、MMP13和ADAMTS4表(biao)達(da)的(de)(de)(de)增(zeng)強(qiang)，SOX9、COL2A1和aggrecan表(biao)達(da)的(de)(de)(de)降低。抑制miR-1271的(de)(de)(de)表(biao)達(da)時，基質降解和合成相關(guan)蛋白的(de)(de)(de)表(biao)達(da)水平則(ze)與此相反（圖3）。

圖3 CircSERPINE2作為miR-1271的海綿在HC細胞發揮作用

4.CircSERPINE2通過靶向miR-1271的表達在OA中發揮作用

將sh-CircSERPINE2和miR-1271海(hai)(hai)綿腺(xian)病毒共感(gan)染(ran)細胞(bao)(bao)(bao)。已(yi)知下調(diao)CircSERPINE2的(de)(de)表達(da)可增加HC的(de)(de)凋亡率，而(er)抑(yi)制miR-1271和CircSERPINE2的(de)(de)表達(da)可顯著(zhu)(zhu)挽救HC的(de)(de)凋亡率。與(yu)單獨感(gan)染(ran)sh-CircSERPINE2和miR-1271海(hai)(hai)綿腺(xian)病毒的(de)(de)細胞(bao)(bao)(bao)相比(bi)，共感(gan)染(ran)sh-CircSERPINE2和miR-1271海(hai)(hai)綿腺(xian)病毒的(de)(de)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)，MMP13、MMP3和ADAMTS4的(de)(de)蛋白和mRNA水平顯著(zhu)(zhu)降低，SOX9、COL2A1和aggrecan的(de)(de)蛋白和mRNA水平則顯著(zhu)(zhu)提高。IF結(jie)果顯示與(yu)用CircSERPINE2抑(yi)制劑(ji)處理(li)過的(de)(de)細胞(bao)(bao)(bao)相比(bi)，CircSERPINE2和miR-1271表達(da)抑(yi)制劑(ji)處理(li)的(de)(de)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)，COL2A1和aggrecan表達(da)水平升高，而(er)MMP13和ADAMTS4表達(da)水平降低，表明(ming)CircSERPINE2在體外(wai)通過靶向(xiang)miR-1271發揮作用（圖4）。

圖4 miR-1271表達下調逆轉HC細胞CircSERPINE2誘導的軟骨降解

5.miR-1271直接作用于ETS相關基因

miR-1271和(he)CircSERPINE2作(zuo)用靶點研究發現(xian)E26轉化特異性相(xiang)(xiang)關(guan)基(ji)因（ERG）對COL2A1、aggrecan、MMP3和(he)MMP13表(biao)達(da)水平的(de)(de)影響(xiang)最(zui)為明(ming)顯(xian)，在OA受(shou)損軟(ruan)骨區域(yu)顯(xian)著下調。ERG是(shi)miR-1271的(de)(de)一(yi)個預(yu)測靶標，熒(ying)光素酶(mei)檢測結果顯(xian)示，miR-1271 mimic明(ming)顯(xian)抑制轉染WT ERG 3 ' -UTR細胞的(de)(de)熒(ying)光素酶(mei)活(huo)性，降(jiang)低ERG的(de)(de)蛋白和(he)mRNA表(biao)達(da)水平，而miR-1271 inhibitor則顯(xian)示出相(xiang)(xiang)反的(de)(de)作(zuo)用。ERG過表(biao)達(da)降(jiang)低MMP3、MMP13和(he)ADAMTS4的(de)(de)表(biao)達(da)，提(ti)高SOX9和(he)COL2A1的(de)(de)表(biao)達(da)，表(biao)明(ming)miR-1271確實靶向ERG，內源性ERG表(biao)達(da)與OA發病機制密切相(xiang)(xiang)關(guan)。

Pre-miR-1271腺病毒感染抑制ERG的(de)表達(da)，明(ming)顯降低HCs中COL2A1、SOX9和(he)aggrecan的(de)表達(da)，增加MMP3、MMP13和(he)ADAMTS4的(de)表達(da)，ERG過表達(da)后這些作用被消除。表明(ming)miR-1271過表達(da)通過調節ERG損害軟骨(gu)表型（圖5）。

圖5 ERG是miR-1271的直接靶點，介導miR-1271在HC細胞中的功能

6.注射CircSERPINE2可緩解OA兔的癥狀

為了確定CircSERPINE2是否在體內OA的進展中發揮作用，作者將WT或MUT腺相關病毒(AAV) CircSERPINE2（由維真生物構建和包裝）通過關(guan)節(jie)內注(zhu)(zhu)射(she)入前交叉韌帶橫切(ACLT)誘(you)導的OA兔體內。結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)(xian)(xian)示OA兔在注(zhu)(zhu)射(she)WT AAV CircSERPINE2后軟骨表面(mian)(mian)得到了改善(shan)，而注(zhu)(zhu)射(she)MUT AAV CircSERPINE2則(ze)無改善(shan)。國際骨關(guan)節(jie)炎(yan)研究協會(hui)(OARSI)評分顯(xian)(xian)(xian)(xian)示，WT AAV CircSERPINE2顯(xian)(xian)(xian)(xian)著降低了OARSI評分，而MUT AAV CircSERPINE2則(ze)提高(gao)了OARSI評分。顯(xian)(xian)(xian)(xian)微CT圖(tu)像顯(xian)(xian)(xian)(xian)示OA兔骨贅增(zeng)加(jia)，而關(guan)節(jie)內注(zhu)(zhu)射(she)CircSERPINE2的OA兔骨贅減(jian)少。免疫組化(hua)和(he)WB結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)(xian)(xian)示，注(zhu)(zhu)射(she)WT AAV CircSERPINE2減(jian)輕(qing)兔OA模(mo)型(xing)軟骨基質(zhi)的退(tui)行(xing)性變化(hua)，如細胞(bao)凋亡增(zeng)強(qiang)和(he)分解代謝(xie)反應(ying)增(zeng)強(qiang)，ECM組成(cheng)增(zeng)加(jia)。綜上所(suo)述，CircSERPINE2的升高(gao)在抑制ECM分解代謝(xie)、促進(jin)合成(cheng)代謝(xie)和(he)減(jian)輕(qing)體內OA方面(mian)(mian)具有積極(ji)作用（圖(tu)6）。

圖6 CircSERPINE2減輕OA兔癥狀

小結

本研究發(fa)現(xian)circRNA：CircSERPINE2 通過SERPINE2基因第2個至第4個外顯(xian)子(zi)反(fan)向拼接(jie)產生，其序(xu)列在人與(yu)(yu)兔之間較為保(bao)守，是一(yi)個參與(yu)(yu)OA的(de)(de)關鍵(jian)下調circRNA；CircSERPINE2含有(you)保(bao)守的(de)(de)miR-1271靶點，miR-1271在OA中的(de)(de)表達顯(xian)著上調，且與(yu)(yu)SOX9、aggrecan和COL2A1的(de)(de)表達呈負(fu)相關， CircSERPINE2通過靶向miR-1271-ERG途徑抑制HCs凋亡，促(cu)進(jin)ECM合成并抑制ECM分解(jie)代謝，發(fa)揮(hui)抗(kang)OA作(zuo)用。CircSERPINE2-miR-1271-ERG軸將成為預防和治(zhi)療OA的(de)(de)新(xin)靶點。