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《Cell》‖ 浙江大學靳津和東南大學柴人杰研究團隊聯合發文:應激反應致外周CD4+ T細胞代謝紊亂誘發焦慮行為

應激反應是各種緊張性刺激物引起的個體非特異性反應，包括生理反應和心理反應兩大類。生理反應表現為交感神經興奮、垂體和腎上腺皮質激素分泌增多、血糖升高、血壓上升、心率加快等；心理反應包括情緒反應與自我防御反應等。研究發現應激反應會引起外周T淋巴細胞功能紊亂，腦神經可塑性的變化，增加抑郁和焦慮的風險。T淋巴細胞在情感障礙疾患中的調節機制和病理性作用是怎樣的呢？浙江大學靳津和東南大學柴人杰研究團隊使用維真生物AAV-shRNA產品在《Cell》（IF=38.637）雜志聯合發表“Stress-Induced Metabolic Disorder in Peripheral CD4+T Cells Leads to Anxiety-like Behavior”的研究論文，文章揭示了CD4+ T細胞嘌呤代謝紊亂與應激誘導的焦慮行為之間的關聯。

研究結果

1. CD4+ T細胞在應激誘導的焦慮行為中起重要的作用

作者通過足部電擊 (electronic foot shock，ES)野生型（WT）和(he)Rag1-/- （免(mian)疫缺陷）小(xiao)鼠誘發(fa)焦(jiao)慮(lv)(lv)模型，開場試(shi)驗（Open Field Test，OFT）發(fa)現，Rag1-/-小(xiao)鼠對(dui)中心區域探索和(he)運動的(de)興趣沒有(you)降低，與研(yan)究報道急性ES小(xiao)鼠的(de)外周血管CD4+和(he)CD8+淋巴細(xi)胞數量明(ming)(ming)顯(xian)增加結果一致(zhi)，表(biao)明(ming)(ming)焦(jiao)慮(lv)(lv)發(fa)生的(de)起(qi)始階段免(mian)疫系統會適應性的(de)改(gai)變。

通過靜脈注(zhu)射中和(he)抗(kang)體來耗(hao)盡CD4+和(he)CD8+細胞(bao)(bao)，作(zuo)者發(fa)現只有CD4+ T細胞(bao)(bao)的(de)去除(chu)顯著逆轉了OFT和(he)高架十字迷宮實驗(yan)（elevated plus-maze test，EPM）ES誘(you)導(dao)的(de)焦(jiao)慮行(xing)(xing)為。CD4+ T細胞(bao)(bao)缺乏可(ke)以(yi)阻止(zhi)急性束縛應激（acute restraint stress，RS）引起小鼠產(chan)生焦(jiao)慮。上述結果表(biao)明(ming)CD4+ T細胞(bao)(bao)對物(wu)理應激誘(you)發(fa)的(de)焦(jiao)慮行(xing)(xing)為有著廣泛(fan)的(de)影響。

為(wei)評價T細胞是否具有(you)焦(jiao)慮印(yin)跡保(bao)留作用，將NT小鼠(shu)和(he)ES小鼠(shu)脾臟(zang)CD4+或CD8+ T細胞分(fen)別過繼(ji)轉移(yi)到Rag1-/- 小鼠(shu)，發現(xian)只(zhi)有(you)接受(shou)ES誘導的(de)CD4+T細胞的(de)Rag1-/-小鼠(shu)在OFT中產生焦(jiao)慮行為(wei)，且初始CD4+ T細胞引發的(de)焦(jiao)慮程度要比效應T細胞更嚴重。（實驗結果(guo)如圖1）

圖1  CD4+ T細胞在應激誘導的焦慮行為中起重要作用

2. 應激誘導外周血CD4+T細胞線粒體分裂

測(ce)序分析ES小(xiao)鼠的(de)(de)CD4+和(he)(he)CD8+ T細(xi)(xi)胞RNA轉錄(lu)組，CD4+ T細(xi)(xi)胞中鑒定出(chu)128個特異性差異表(biao)達(da)基因(DEGs)，基因本(ben)體(ti)分析顯(xian)示(shi)(shi)大多數DEGs編(bian)碼線(xian)粒體(ti)蛋白質(zhi)。胞外酸化速(su)(su)率(lv)（extracellular acidification rate, ECAR）和(he)(he)耗氧(yang)速(su)(su)率(lv)（axygen consumption rate, OCR）測(ce)定顯(xian)示(shi)(shi)，ES和(he)(he)RS小(xiao)鼠初(chu)始(shi)CD4+ T細(xi)(xi)胞的(de)(de)糖酵解和(he)(he)氧(yang)化磷酸化水平均顯(xian)著(zhu)下(xia)降，線(xian)粒體(ti)的(de)(de)結(jie)構(gou)和(he)(he)功能(neng)受到影響(xiang)。通過(guo)共聚焦顯(xian)微成像和(he)(he)免(mian)疫印跡技術檢測(ce)，發現ES初(chu)始(shi)CD4+ T細(xi)(xi)胞的(de)(de)線(xian)粒體(ti)呈點狀(zhuang)(zhuang)，線(xian)粒體(ti)融合的(de)(de)外膜蛋白MFN2和(he)(he)MIGA2顯(xian)著(zhu)減少(shao)，表(biao)明CD4+ T細(xi)(xi)胞在應激(ji)狀(zhuang)(zhuang)態下(xia)表(biao)現為(wei)線(xian)粒體(ti)形態異常(chang)和(he)(he)代謝功能(neng)障礙。

研(yan)究(jiu)發(fa)現白三(san)烯B4（LTB4）給(gei)藥(yao)會使小鼠產生嚴(yan)重的焦(jiao)慮行(xing)為，去(qu)除CD4+ T細胞(bao)后焦(jiao)慮行(xing)為消失。體外實驗(yan)顯示(shi)在(zai)應激反(fan)應中(zhong)LTB4顯著增加線粒體分裂(lie)，降低了MFN2和MIGA2在(zai)初始CD4 + T細胞(bao)中(zhong)的表達。研(yan)究(jiu)證明應激反(fan)應可(ke)誘導LTB4啟動外周血(xue)CD4+ T細胞(bao)線粒體的裂(lie)變(bian)，并(bing)引發(fa)焦(jiao)慮。（實驗(yan)結果如圖2）

圖2  應激導致CD4+ T細胞代謝紊亂和線粒體裂變

為了確定T細胞線粒體形態與焦慮行為的關系，作者建立了Miga2-/-小鼠，OFT、EPM、暗-光轉換和懸尾實驗中，Miga2-/-小鼠表現出嚴重的抑郁癥狀，并在初始CD4+ T中觀察到了高度破碎的線粒體。為了進一步闡明外周血CD4+ T細胞線粒體分裂的特殊功能，作者生成了Miga2 T細胞條件敲除(KO) (Miga2TKO)小鼠。缺乏Miga2的T細胞在T淋巴細胞的發育和穩態方面沒有表現出任何明顯的異常，但Miga2TKO小鼠仍然表現出類似于Miga2-/-小鼠的焦慮樣行為。Miga2TKO小鼠在連續EPM測試中表現出正常的恐懼記憶消失，說明Miga2缺陷的CD4+ T細胞對正常的學習記憶沒有影響。為了消除Miga蛋白在焦慮中的特殊功能，作者又生成了Mfn1和Mfn2 T細胞條件下雙KO (Mfn1/ 2TKO)小鼠(shu)，T細(xi)胞(bao)中缺乏Mfn1/2的(de)小鼠(shu)與野(ye)生(sheng)型(xing)小鼠(shu)相比也表現出類似焦(jiao)慮的(de)行為，這(zhe)表明焦(jiao)慮行為是由線粒體形態紊亂引起(qi)的(de)，而不是由某些線粒體蛋白的(de)特定功能(neng)引起(qi)的(de)。（實驗結果如圖3）

圖3  CD4+ T細胞線粒體的持續分裂導致產生焦慮行為

3. T細胞線粒體的持續裂變導致全身嘌呤代謝紊亂

聚類分析顯示Miga2TKO小(xiao)鼠的(de)(de)代(dai)謝(xie)組學特征與同窩(wo)WT小(xiao)鼠有顯著差(cha)(cha)異，代(dai)謝(xie)產物的(de)(de)差(cha)(cha)異主要集(ji)中(zhong)于嘌呤(ling)代(dai)謝(xie)。Miga2TKO小(xiao)鼠體內嘌呤(ling)及(ji)其(qi)衍生物（腺嘌呤(ling)、次黃(huang)嘌呤(ling)和黃(huang)嘌呤(ling)）的(de)(de)含(han)量是同窩(wo)野生型小(xiao)鼠的(de)(de)10-100倍。去(qu)除CD4+ T細胞后，Miga2TKO小(xiao)鼠血清(qing)黃(huang)嘌呤(ling)濃(nong)度(du)顯著降低。在兩種嚙齒動物焦(jiao)慮模型和過繼性轉(zhuan)移ES小(xiao)鼠CD4+ T細胞的(de)(de)Rag1-/-小(xiao)鼠血清(qing)中(zhong)也觀察到黃(huang)嘌呤(ling)濃(nong)度(du)明細增加。

WT小(xiao)(xiao)鼠體內注射合(he)成的(de)(de)黃(huang)嘌(piao)呤(ling)或(huo)腺(xian)(xian)苷(gan)發現，黃(huang)嘌(piao)呤(ling)、腺(xian)(xian)嘌(piao)呤(ling)和單磷酸(suan)阿糖腺(xian)(xian)苷(gan)都能引發小(xiao)(xiao)鼠產生(sheng)焦(jiao)慮行(xing)為。BCX-1777（嘌(piao)呤(ling)核苷(gan)磷酸(suan)化酶抑(yi)制劑(ji)）明顯降(jiang)低Miga2TKO和ES小(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)焦(jiao)慮癥(zheng)狀，同時(shi)顯著降(jiang)低小(xiao)(xiao)鼠血(xue)清黃(huang)嘌(piao)呤(ling)的(de)(de)濃度。由此(ci)可知，病理性CD4+ T細(xi)胞引起(qi)的(de)(de)黃(huang)嘌(piao)呤(ling)過(guo)量在焦(jiao)慮行(xing)為中起(qi)至關重要(yao)的(de)(de)作用。（實驗結果如圖4）

圖4  CD4+ T細胞線粒體的分裂導致血清嘌呤增加

4. 黃嘌呤直接作用于小鼠左側杏仁核的少突膠質細胞

研究表明杏仁核在恐懼和持續焦慮的產生起關鍵作用，左杏仁核與社交焦慮、強迫癥、創傷后應激以及焦慮有關。組織學分析發現，Miga2TKO小鼠左杏仁核比右杏仁核和WT小鼠杏仁核更大，非神經元細胞的數量更多。經黃嘌呤處理的小鼠左杏仁核表現出與Miga2TKO小(xiao)鼠相似的(de)病(bing)理表型(xing)。單細胞RNA測序顯(xian)示，腺嘌呤(ling)和黃嘌呤(ling)發(fa)(fa)揮通過A1、A2A、A2B和A3四種(zhong)受(shou)體(ti)亞型(xing)發(fa)(fa)揮各自的(de)生理功(gong)能，且A1在少突膠質細胞中大量表達。

作者分析了 WT、Miga2-/-、αCD4處理的Miga2-/-小鼠杏仁核中非神經元細胞的轉錄組。scRNA 序列和FACS分析顯示Miga2-/-小鼠少突膠質細胞比例顯著增加，去除CD4+ T細胞可逆轉此現象。BRdU摻入試驗發現，黃嘌呤作為致病因素，可顯著增加少突膠質細胞的DNA合成和細胞周期，直接誘發少突膠質細胞的增殖。已有資料表明黃嘌呤作用于A1受體并促進蛋白激酶A (PKA)/ cAMP的活性。作者發現Miga2-/-小鼠少突膠質細胞中PKA/ cAMP通路被明顯激活，耗盡CD4+T細胞可下調該通路。作為左側杏仁核少突膠質細胞唯一可檢測到的腺苷受體A1，通過注射腺相關病毒AAV-MBP-shAdor1-GFP（維真生物提供）成功地特異性敲低A1受體，Miga2-/-小鼠(shu)不再表現出焦慮癥(zheng)狀。（實(shi)驗結果如圖5）

圖5  CD4+ T細胞來源的黃嘌呤通過A1受體作用于左杏仁核的少突膠質細胞

5. 線粒體裂變促進CD4+ T細胞中黃嘌呤的合成

嘌呤有兩種合成途徑：從頭合成和回收。在從頭合成途徑中，葡萄糖代謝產物5-磷酸糖苷基-1-焦磷酸(PRPP)提供了形成嘌呤環的骨架結構。研究發現Miga2-/-和Mfn1/2TKO小鼠(shu)(shu)CD4+ T細胞氧化(hua)(hua)磷(lin)酸化(hua)(hua)和(he)(he)糖(tang)(tang)酵解活性顯著(zhu)降低，但5-磷(lin)酸核糖(tang)(tang)（R-5-P）、CAIR、腺苷和(he)(he)肌苷則大量增加(jia)，表明線粒(li)體在從融合到裂變(bian)過程中，葡(pu)(pu)萄糖(tang)(tang)通過磷(lin)酸戊糖(tang)(tang)途徑（PPP）重新(xin)合成(cheng)嘌呤。2-脫(tuo)氧-D-葡(pu)(pu)萄糖(tang)(tang)（抑(yi)制糖(tang)(tang)酵解、PPP和(he)(he)嘌呤的(de)合成(cheng)）可使(shi)Miga2TKO小鼠(shu)(shu)的(de)焦慮癥(zheng)狀和(he)(he)左杏仁核病理特(te)征恢復(fu)正常。

WT和Miga2-/-小鼠初始CD4+ T細胞的轉錄組分析表明，Miga2-/-小鼠的 CD4 + T細胞與糖酵解和脂肪酸?氧化途徑相關的多個關鍵酶轉錄水平顯著降低，但是嘌呤合成所需的分子：己糖激酶3 (Hk3)、腺苷脫氨酶(Ada)、嘌呤核苷磷酸化酶2 (Pnp2)和黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤脫氫酶(Xdh)有所增加。PNP催化肌苷和鳥苷轉化為次黃嘌呤或鳥嘌呤。與PNP相似，PNP2也是一種調節嘌呤代謝途徑和黃嘌呤產生的酶，由于其在初始CD4+ T細胞中的低表達，認為其缺乏可能不會像PNP缺乏那樣導致嚴重的免疫缺陷。Pnp2-/-小鼠未表現出任何明顯的T淋巴細胞發育或成熟障礙，進一步與Miga2-/-小鼠雜交產生Pnp2-/-/Miga2-/-小鼠，當Pnp2-/-/Miga2-/-CD4+ T細胞過繼轉入Rag1-/-小鼠后，Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T細胞不像Miga2-/- CD4+ T細胞那樣引起焦慮癥狀。由于Pnp2缺失不能完全阻斷黃嘌呤的合成，在移植Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T細胞的Rag1-/- 小鼠血清(qing)中，黃嘌(piao)呤仍有適度升高(gao)。這些(xie)結(jie)果表明CD4+ T細(xi)胞來源的(de)過量黃嘌(piao)呤可直接導致(zhi)焦慮行為。（實驗結(jie)果如圖(tu)6）

圖6  CD4+ T細胞線粒體的裂變促進嘌呤從頭合成途徑

干擾(rao)素調節因子-1（IRF-1）作為(wei)一種(zhong)轉錄因子，參(can)與(yu)細胞(bao)(bao)增殖、分化、凋亡和(he)(he)免疫調節等多種(zhong)細胞(bao)(bao)過程。作者發現Miga2-/-和(he)(he)ES小鼠(shu)CD4+T細胞(bao)(bao)中(zhong)IRF-1顯著積累。染色質免疫共沉(chen)淀技術研(yan)究表明巨噬細胞(bao)(bao)IRF-1富集于Ada、Xdh和(he)(he)Pnp2的(de)(de)啟(qi)動子區(qu)域。IRF-1缺乏使Miga2-/-小鼠(shu)CD4+ T細胞(bao)(bao)Ada和(he)(he)Xdh mRNA和(he)(he)蛋白水(shui)平(ping)恢復正常化，減輕了Miga2TKO小鼠(shu)的(de)(de)焦慮(lv)行為(wei)。CD4+ T細胞(bao)(bao)中(zhong)的(de)(de)IRF-1在線粒(li)體裂(lie)變調節嘌呤(ling)合成并產生(sheng)焦慮(lv)癥狀中(zhong)起著至關重(zhong)要的(de)(de)作用。（實驗結果(guo)如(ru)圖7）

圖7  IRF-1的積累促進嘌呤合成和焦慮行為

結論

本(ben)研究揭示了外周血CD4+ T細胞來源(yuan)的黃嘌呤和焦慮行為之間(jian)的重要(yao)聯系。如下：

小V相信AAV-shRNA相關產品將對各種精神(shen)和(he)代謝疾病藥(yao)物的研發(fa)提供巨大幫助(zhu)。