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縫隙連接（Gap junctions）又稱間隙連接，是一種重要的跨細胞通道，可以介導分子量小于約1 kD的小分子（如cAMP，IP3，Glucose等第二信使）或離子（氫離子、鈣離子、鉀離子等）在細胞間的擴散。這種通道廣泛地存在于包括脊椎動物和無脊椎動物的各類組織和器官中，介導細胞間的化學和電學信號傳遞，從而調控發育、維持穩態，保證生物體各個系統的正常工作。縫隙連接功能的缺陷與許多疾病有關，包括心肌梗死、聽力喪失和低髓鞘性疾病等。

連接蛋白存在于興奮和非興奮的組織中，除了分化的骨骼肌、紅細胞和成熟精子細胞之外的所有組織中都有表達。連接蛋白編碼基因的突變與多種遺傳疾病（包括耳聾、神經病、白內障、骨骼異常和皮膚病）的發生相關，它們調節免疫反應、細胞增殖、遷移、凋亡和癌變的能力使之成為多種疾病的治療靶點。

已有研究證明連接蛋白在內質網中合成，在高爾基體中加工形成半通道。新合成的連接蛋白組裝成連接子，隨后被運輸并插入到質膜中。在細胞接觸過程中，連接子與對應細胞的連接子正面對接并聚集形成縫隙連接斑塊。一旦細胞間通訊不再需要縫隙連接斑塊，或細胞遷移，縫隙連接斑塊的一部分（通常是中心部分）或整個斑塊內化，形成環狀縫隙連接。環狀縫隙連接可以通過一系列過程降解，包括溶酶體、自噬體等過程。環狀縫隙連接囊泡或在環狀縫隙連接囊泡降解過程中釋放的連接蛋白可能會回到細胞表面循環利用，參與新的或現有縫隙連接斑塊的形成（圖4）。

縫隙連接在各種生理過程中發揮重要作用，而在復雜系統（神經系統）的生理或疾病條件下研究縫隙連接耦合需要一種既具有細胞特異性又具有高時空分辨率的非侵入性方法，然而以往用于監測縫隙連接的方法包括電生理記錄、染料微注射、熒光漂白恢復(FRAP)和分子熒光探針的局部激活（LAMP），均缺乏細胞特異性及高時空分辨率，并且具有侵入性，因此限制了它們的應用。

為了更好地研究縫隙連接在復雜系統中的分布及生理和病理條件下的功能，2019年，北京大學李毓龍課題組開發了一種新型的、可基因編碼的光遺傳學縫隙連接檢測探針——PARIS（pairing actuators and receivers to optically isolate gap junctions），并將其應用在細胞系、心肌細胞和轉基因果蠅的神經系統中重復地檢測特定細胞間的縫隙連接通訊。該方法首次實現了運用完全遺傳編碼的方法在特異的細胞類型中非侵入地對縫隙連接通訊進行成像，它結合了光學的高度時空操縱性和遺傳學的特異性，為研究縫隙連接通訊的在體分布、不同生理活動下的功能及調節提供了更多的可能性。

圖5. PARIS的作用原理示意圖

PARIS包含兩部分：第一部分是一個光控質子“泵”（ArchT），它將氫離子輸送出細胞；第二部分是一個熒光傳感器（質子敏感型熒光蛋白pHluorin，所用AdV-pHluorinCAAX腺病毒由維真生物提供），存在于接收信號的細胞內，它對流出的氫離子做出反應。將二者分別表達在縫隙連接耦合的細胞中，通過光激活質子泵產生跨細胞的質子梯度，再通過pHluorin的熒光變化檢測兩個相鄰細胞間的縫隙連接通訊（如圖5所示）。

原文鏈接：

研究思路

部分研究結果

1、PARIS與FRAP（熒光漂白恢復技術）在HEK293T細胞中的功能比較

通過對PARIS與FRAP（基于染料擴散的方法檢測縫隙連接介導的光漂白后的熒光恢復）的比較發現，相同時間內PARIS信號比FRAP信號更加穩定，未曾出現衰減，而且PARIS信號的動力學比FRAP快速，對應的t_1/2分別約為~21s和~197s（圖6）。

圖6. PARIS與FRAP在HEK293T細胞中的比較

2、PARIS可檢測縫隙連接和由連接蛋白編碼基因突變引起的疾病

研究表明，磷酸化通過影響縫隙連接的組裝、降解和門控等途徑參與其調節。接下來，作者探討了PARIS是否可以在蛋白磷酸化等調節條件下檢測縫隙連接：用cAMP類似物8-Br-cAMP、腺苷酸環化酶激動劑Forskolin及蛋白激酶C（PKC）激動劑TPA處理表達PARIS的HEK293T細胞。與對照組相比，經TPA處理細胞后，PARIS信號受到顯著抑制，而8-Br-cAMP和Forskolin的處理對其未造成明顯影響，表明PKC的激活會抑制縫隙連接。

已知連接蛋白Cx43編碼基因GJA1的突變與許多疾病有關，那么PARIS是否可以用來檢測連接蛋白編碼基因突變引發的疾病呢？作者在不表達內源性連接蛋白的HeLa細胞中表達了PARIS，光激活“質子泵”細胞時，接收器細胞中未產生PARIS信號；而在表達GJA1的HeLa細胞中，光激活“質子泵”細胞時，相鄰接收器細胞中產生了強烈的熒光。由于Cx43編碼基因GJA1的突變影響了縫隙連接的形成，從而使PARIS信號顯著降低。上述結果表明，PARIS可用于檢測縫隙連接蛋白編碼基因突變造成的疾病（圖7）。

圖7. PARIS可檢測縫隙連接和由連接蛋白基因突變引起的疾病

3、PARIS可用于報告測心肌細胞間的縫隙連接

由連接蛋白Cx40、Cx43和Cx45形成的縫隙連接在心肌細胞中起著重要作用，它們的的缺陷與心血管疾病有關。作者用培養的新生大鼠心肌細胞，光刺激“質子泵”心肌細胞，在相鄰接收器心肌細胞中產生了強烈的熒光，并且這種熒光響應可以被縫隙連接阻滯劑Heptanol可逆阻斷。此外，光刺激“質子泵”心肌細胞不影響細胞中自發的鈣離子瞬變速率以及細胞搏動的速率，說明PARIS的表達和激活不影響細胞的功能（圖8）。

圖8. PARIS可監測心肌細胞間的縫隙連接

4、PARIS可監測轉基因果蠅特定神經元間的縫隙連接

接著，作者檢測了PARIS是否可以用來測量腦細胞間的縫隙連接活動（電突觸）。首先，作者在果蠅嗅覺通路的興奮性投射神經元（ePNs）中表達了PARIS系統，并測量了PARIS信號，結果顯示ePNs中的自主PARIS信號可被重復誘導長達2小時，并且信號強度無明顯減弱，表明PARIS在完整的活體組織中是穩定的。

隨后，作者利用PARIS測量了轉基因果蠅興奮性投射神經元（ePNs）和興奮性局部神經元（eLNs）間的電突觸——兩者在觸角葉（AL）中都有樹突狀分支：在ePNs中選擇性地表達光控質子“泵”（GH146-QF > QUAS ArchT），在eLNs中選擇性地表達熒光傳感器（Kras-Gal4 >UAS pHluorinCAAX）。在AL中直徑為20 um的區域施加光刺激，引起了pHluorinCAAX熒光的快速增加，半上升和半衰減時間分別約為12 s和29 s，這與先前報道的電生理數據一致，表明ePNS和eLNS是電耦合的。用CBX處理轉基因蒼蠅或在突變體ShakB²果蠅大腦中（縫隙連接蛋白發生突變）并未出現類似熒光響應，證實了PARIS可用來測量轉基因果蠅特定神經元間的縫隙連接。

作者又將AL劃分為四個區域，光刺激可以誘導每個區域的熒光增加，表明電耦合在AL中EPNS和ELNS之間是普遍存在的（圖9）。

圖9. PARIS檢測轉基因果蠅特定神經元間的縫隙連接

5、PARIS可報告轉基因果蠅不同神經元結構中的功能性縫隙連接

在果蠅嗅覺系統中，抑制投射神經元（iPNs）和ePNs形成縫隙連接，參與對氣味信息的處理；并且ePNS和iPNS都有投射到AL中的樹突以及投射到側角（LH）的軸突。因此，目前尚不清楚在AL、LH或兩者中的iPNS和ePNS之間是否形成縫隙連接。

作者在iPNS中表達了光控質子“泵”（Mz699-Gal4 > UAS ArchT），在ePNS中表達了熒光傳感器（GH146-QF > QUAS pHluorinCAAX），然后光刺激AL或LH中ePNS-iPNS重疊的區域，檢測是否存在功能性縫隙連接。結果顯示，光刺激AL，而不是LH，引起了pHluorinCAAX熒光的顯著增加，并且用CBX處理后熒光響應被消除。上述結果表明iPNS和ePNS在AL處通過樹突-樹突接觸形成功能性縫隙連接，而不是在LH中通過軸突-軸突接觸。

圖10. PARIS監測轉基因果蠅不同神經元間的縫隙連接

作者還進一步優化了PARIS系統，通過生物信息學篩選出了比ArchT膜轉運性能更優異、光靈敏度更強（約25倍）的新質子泵Lari，擴展了PARIS系統在未來體內應用的前景（圖11）。

圖11. 對PARIS系統的進一步優化