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作者以阿爾茲海默癥轉基因小鼠模型APP/PS1為研究對象，將AAV-MCL-1過表達載體注射至小鼠的海馬區，結果顯示，過表達MCL-1基因能顯著改善APP/PS1小鼠的認知功能，而且海馬區細胞外的Aβ斑塊出現減少。此外，MCL-1的過表達也提高了野生型小鼠的學習和記憶能力，這表明MCL-1能在神經元中發揮非常重要的作用。

 阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease ，AD）是一種由神經元死亡而造成的神經變性疾病——以進行性記憶力減退和獲得性知識喪失，直至日常生活活動能力完全喪失為特征，給社會和家庭帶來沉重負擔，成為嚴重的社會和醫療衛生問題。阿爾茨海默病是繼心血管病、腦血管病和腫瘤之后，威脅老年人健康的重要疾病。目前，全球約有5000萬人罹患阿爾茲海默癥。預計到2050年，這個數字將增加至1.52 億。當前，全球每年用于治療、護理阿爾茲海默癥病人的費用已經達到1萬億美元，而這一數字將在2030年達到目前的兩倍。

 阿爾茨海默病的病因復雜，目前主流觀點認為是由β淀粉樣蛋白（Aβ）和微管相關蛋白Tau沉積造成神經元大量死亡引發的，1998年以來，有100余種治療此病的藥物進行臨床試驗，但僅有6種針對此病癥的藥物獲得FDA的批準上市，而且近年來世界各大制藥公司針對Aβ或Tau蛋白開發的藥物均遭到了不同程度的失敗，這給人類對于AD的攻克埋上了一層巨大的陰影。

 線粒體功能障礙是AD的一個基本病理特征，在散發性和家族性AD病例以及AD動物模型中，均被發現有受損的神經元線粒體的積累。功能受損的線粒體會觸發能量應激，從而促進Aβ寡聚化和Tau過度磷酸化。線粒體合成調節因子PGC-1α的表達變化以及線粒體功能失調導致的鈣穩態失衡都已被證實與AD的發生有關。新的研究表明，AD患者的腦細胞中線粒體自噬受到損害，能造成大量損傷性線粒體積累，導致突觸功能障礙和認知功能的下降。因此，保障AD患者神經細胞中線粒體自噬的正常進行至關重要，而找到一種誘導線粒體自噬的藥物靶點則是重中之重。

 近期，浙江大學基礎醫學院夏宏光教授團隊在《Nature communications 》（IF=12.121）上在線發表了一篇關于阿爾茨海默病的最新研究成果—Pharmacological targeting of MCL-1 promotes mitophagy and improves disease pathologies in an Alzheimer’s disease mouse model。該研究首次揭示了抗凋亡蛋白MCL-1作為線粒體自噬受體蛋白介導線粒體自噬的新機制，MCL-1的特異性抑制劑UMI-77可以在AD模型小鼠中顯著緩解阿爾茨海默病的病理特征，改善小鼠認知；本研究提出靶向MCL-1蛋白誘導線粒體自噬是一種有巨大前景的治療阿爾茨海默癥的策略。

UMI-77作用機制示意圖

 首先，研究人員通過利用熒光蛋白Keima構建敏感的線粒體自噬定量檢測方法，對穩定表達mt-Keima（Keima蛋白具有在酸性和中性pH中熒光信號不同的特性，定位于線粒體中的Keima（mt-Keima）可顯示通過自噬途徑進入溶酶體中的線粒體，直觀地反映線粒體自噬程度）的HEK293T細胞系和一個包含2024個FDA批準的藥物或候選藥物庫進行小分子化合物高通量篩選，找到了一種可以安全有效誘導線粒體自噬的小分子化合物——UMI-77，一種Bcl-2家族抑制劑。

 研究表明，UMI-77是抗凋亡蛋白MCL-1的特異性抑制劑，能阻斷MCL-1和Bax/Bak之間的相互作用，從而允許Bax/Bak誘導細胞凋亡。研究者通過測定線粒體的去極化及自噬水平，發現與CCCP(氧化磷酸化抑制劑，影響線粒體的蛋白合成)相比，UMI-77在亞致死劑量下不會誘導HEK293T和HeLa細胞的線粒體損傷；在HEK293T-mt-Keima中，UMI-77+CCCP聯合使用明顯增強了線粒體的自噬水平，表明UMI-77不會造成線粒體損傷，且能夠促進線粒體自噬，且能增強CCCP誘導的線粒體損傷引發的線粒體自噬。HEK293T-mt-Keima細胞的活細胞成像實驗、透射電子顯微鏡（TEM）觀察及western bloting 實驗也證實了UMI-77的促線粒體自噬作用。

 為排除凋亡誘導劑對線粒體自噬可能的影響，研究者又做了評估實驗。結果發現，藥物庫中大多數誘導細胞凋亡的藥物及pan-caspase抑制劑Z-VAD-fmk（可阻斷細胞凋亡）不會影響UMI-77的促線粒體自噬作用，這表明UMI-77誘導的線粒體自噬，不依賴于凋亡誘導，且UMI-77在亞致死劑量下不會誘導細胞凋亡。與此同時，UMI-77處理后，巨自噬標記物p62和其他細胞器標記物的表達水平并沒有下降，這表明UMI-77可特異性誘導線粒體自噬，不影響非選擇性自噬。

圖1. UMI-77可特異性誘導線粒體自噬

 既然UMI-77能誘導線粒體自噬，MCL-1又是UMI-77的靶點，那么MCL-1是否參與了UMI-77誘導的線粒體自噬的過程呢？研究者對此進行了探索，發現在HEK293T和HeLa細胞中敲除MCL-1基因后減緩了UMI-77誘導的線粒體蛋白Tom20和Tim23的降解，抑制了UMI-77誘導的線粒體自噬水平，這說明MCL-1在UMI-77誘導的線粒體自噬激活中是必須的。

 此前已有研究證明，細胞自噬受體如FUNDC1和FKBP8的過表達能促進細胞自噬，那么MCL-1在線粒體自噬中是否也是扮演自噬受體的角色？為了探究其在自噬中所起的作用，研究者建立強力霉素Dox誘導的MCL-1過表達的HEK293T穩定細胞系（HEK293T- MF2），值得注意的是，HEK293T- MF2中線粒體標志物Tim23的表達水平下降，線粒體變小、片段化，而且線粒體和溶酶體出現了共定位。透射電鏡分析也證實了MCL-1的過表達促進了線粒體自噬。綜上結果表明，MCL-1在線粒體自噬中發揮關鍵作用。

圖2. MCL-1促進線粒體自噬

 研究者對MCL-1在線粒體自噬中是否扮演自噬受體的角色繼續展開研究，并推測UMI-77誘導Bax/Bak中MCL-1釋放后能MCL-1能與LC3發生相互作用，從而促進線粒體自噬。研究發現MCL-1在其C端有三個“LC3-相互作用區（LIR）”基序，其中前兩個基序LIR261-264和LIR318-321位于胞質區，并且LIR261-264具有很強的保守性，這提示它是有一定功能的。

 研究人員首先驗證了UMI-77是否能誘導MCL-1和LC3發生相互作用，通過免疫共沉淀試驗發現，經UMI-77處理后，LC3A與MCL-1的相互作用增強，而Bax與MCL-1的相互作用隨之減弱；在UMI-77的作用下，MCL-1還與其他Atg8家族蛋白相互作用。此外，pull-down實驗也顯示MCL-1能直接與LC3A結合。隨后，研究者又生成了一系列MCL-1 LIR261-264和LIR318 - 321基序的突變體，結果顯示MCL-1 LIR261-264基序突變后減弱了MCL-1與LC3A的相互作用。

 接下來，研究者對UMI-77是否能增強內源性MCL-1和LC3A的相互作用展開了相關研究：結果與我們預期一致，發現用UMI-77處理后，Duolink®PLA結果顯示，在線粒體上能觀察到內源性MCL-1和LC3A相互作用的增強，而未用UMI-77處理時這種相互作用也能觀察到，反映了基礎內源自噬的水平。這個結果進一步表明MCL-1是一個重要的線粒體自噬受體。

 最后，作者又驗證了MCL-1和LC3A的相互作用是否能在UMI-77介導的線粒體自噬激活中起作用。結果顯示，敲除MCL-1后，HEK293T-mt-Keima和SH-SY5Y細胞中UMI-77介導的線粒體自噬水平降低，而補充MCL-1/LIR318-321突變體MCL-1的表達可逆轉此現象。

 綜上所述，MCL-1是一個線粒體自噬受體，它通過其LIR261-264基序與LC3A直接作用，并且這種相互作用能被UMI-77增強進而導致線粒體自噬水平的增強。此外，MCL-1和LC3A之間的相互作用是UMI-77介導線粒體自噬激活的關鍵。

圖3. MIC-1和LC3A的相互作用是UMI -77誘導線粒體自噬所必需的

 隨后，作者研究了其他線粒體自噬受體蛋白是否在UMI-77誘導的線粒體自噬或MCL-1-LC3A相互作用的誘導中發揮作用。作者以野生型HeLa細胞和四基因敲除的突變體HeLa細胞（敲除線粒體自噬受體NDP52、p62、NBR1和TAX1BP1）為研究對象進行研究，發現UMI-77能顯著增強MCL-1和LC3A之間的相互作用，線粒體標記蛋白Cox II和Tim23的表達水平也均呈現時間依賴性的降低，此外，線粒體自噬受體（FUNDC1, BNIP3和NIX）也被證明不參與UMI-77誘導的線粒體自噬，表明UMI-77誘導的線粒體自噬與這些線粒體自噬受體蛋白無關。

 鑒于UMI-77阻斷了MCL-1與Bax的相互作用，研究者隨后分析了Bax在UMI-77誘導的線粒體自噬中的作用，令人驚訝的是，敲低Bax后UMI-77誘導的線粒體自噬水平增強，說明Bax不參與UMI-77誘導的線粒體自噬。另外兩種MCL-1相互作用蛋白Beclin1和Parkin也先后被排除參與UMI-77介導線粒體自噬激活的可能性。相反，在HEK293T-mt-Keima細胞或MEF細胞中敲除ATG5后抑制了Tom20和Tim23降解，說明ATG5是UMI-77誘導線粒體自噬必需的。

 綜上結果表明，UMI-77誘導的線粒體自噬是通過ATG5自噬通路介導的，不依賴于線粒體自噬受體蛋白NBR1、TAX1BP1、p62、NDP52、FUNDC1、BNIP3、NIX以及MCL-1相互作用蛋白Bax、Beclin1和Parkin。

圖4. UMI-77以ATG5依賴的方式誘導線粒體自噬

 接著，研究者又研究了MCL-1作為線粒體自噬受體的生理功能。研究表明，OGD（氧-糖剝奪）或OGD/再灌注會損傷線粒體，并通過線粒體自噬誘導清除受損線粒體。mt-Keima實驗結果顯示，敲除MCL-1后OGD誘導的線粒體自噬水平顯著降低，線粒體標記蛋白Cox II和Tim23的特異性降解也被抑制，說明MCL-1對OGD誘導的線粒體自噬是必需的。

 已有研究證明MCL-1可調節線粒體的碎片化，因此研究人員試圖了解MCL-1在OGD誘導的線粒體自噬中的作用。免疫熒光顯微鏡觀察到OGD處理后HEK293T細胞線粒體碎裂，而敲除MCL-1改變了這些形態學變化，表明MCL-1在OGD誘導的線粒體碎片化中起著關鍵作用，并且MCL-1 LIR261-264基序僅參與線粒體自噬，而不參與MCL-1的線粒體碎片化調節作用。同樣地，OGD也增強了MCL-1與LC3A的相互作用，降低了其與Bax的相互作用，再次證明MCL-1是一種線粒體自噬激活的受體。

圖5. MCL-1是OGD誘導的線粒體自噬所必需的

 接著，研究人員探究了UMI-77誘導的線粒體自噬對AD模型APP/PS1小鼠疾病病理和行為表型的影響。對4月齡的小鼠腹腔注射10 mg/kg劑量的UMI-77，共持續4個月。通過Morris水迷宮測試發現UMI-77治療明顯改善了APP/PS1小鼠的學習和記憶能力，且能有效降低小鼠腦內不溶性Aβ1-42的水平。同樣，免疫熒光結果也顯示UMI-77治療后海馬區細胞外Aβ斑塊明顯縮小，星形膠質細胞的激活也受到抑制。此外，UMI-77也降低了APP/PS1小鼠的神經炎癥水平，表現為炎癥細胞因子（TNFα和IL-6）水平顯著降低。重要的是，UMI-77顯著恢復了神經元的線粒體形態，這一研究結果與在APP/PS1小鼠中觀察到的通過UMI-77可以誘導線粒體自噬從而清楚受損線粒體相一致。這些結果均表明UMI-77是一種治療AD的有效藥物。

圖6. UMI-77是一種治療AD的有效藥物

最后，研究人員評估了MCL-1介導的線粒體自噬對APP/PS1小鼠行為表型的影響。將AAV-MCL-1過表達載體注射小鼠的海馬區，MCL-1的過表達顯著改善了APP/PS1小鼠的認知功能，并減少了海馬區細胞外的Aβ斑塊。令人驚訝的是，MCL-1的過表達也提高了野生型小鼠的學習和記憶能力，表明MCL-1在神經元中有非常重要的作用。

 綜上所述，MCL-1是一種新的線粒體自噬受體蛋白，是治療阿爾茨海默癥的新藥物靶點；UMI-77可以通過釋放游離的MCL-1蛋白誘導線粒體自噬，顯著恢復APP/PS1 AD小鼠模型的認知功能缺損，減輕炎癥反應和Aβ斑塊引起的病理效應，促進受損線粒體的清除。總而言之，誘導線粒體自噬是治療阿爾茨海默癥的有效策略。