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前幾日，我們為大家介紹了關于反相蛋白微陣列RPPA的有關知識（『癌癥相關蛋白及磷酸化水平大數據等你來分析！），利用RPPA技術可以同時分析成百上千種細胞或者組織樣本中不同蛋白的表達情況，包含修飾后蛋白（如磷酸化、甲基化、乙酰基化）的差異表達比對分析，那么，關于蛋白質翻譯后修飾你了解多少呢，蛋白質磷酸化究竟又是怎么一回事？今天，小V就和大家一起來探索有關蛋白質磷酸化的那些事兒！
蛋白質翻譯后修飾(PTMs)在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質的結構更復雜，功能更完善，調節更精細，作用更專一。蛋白翻譯后修飾包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羥基化、脂酰化、羧基化等共價修飾。其中，蛋白磷酸化是最常見和最重要的翻譯后修飾之一，它在每個生物的各個方面都扮演著重要的角色，例如基因轉錄、表達、細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導、免疫調控、腫瘤發生等。
蛋白磷酸化是在酶的催化作用下，將ATP γ位的磷酸基團，轉移至蛋白質氨基酸側鏈上的過程。該過程是可逆的，催化蛋白質發生磷酸化的酶被稱為蛋白激酶（protein kinase, PK），而催化蛋白質去磷酸化的酶被稱為蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）（圖1）。蛋白磷酸化是調節和控制蛋白質活性和功能的重要機制。
蛋白磷酸化是生物體內普遍存在的一種調節方式。據報道，人類基因組編碼的21000個蛋白質中，90%以上發生了磷酸化。根據被磷酸化的氨基酸殘基不同，蛋白質磷酸化可分為 4 大類，具體分類和磷酸化位點見表1，磷酸化的9個氨基酸分子式見圖2。超過三分之一的蛋白磷酸化發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上：其中絲氨酸殘基最多（86.4%），其次是蘇氨酸殘基（11.8%），酪氨酸殘基最少（1.8%）。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化組成了O-磷酸化。O-磷酸化在酸性條件下非常穩定，因此在細胞生物學和磷酸化蛋白質組學中研究廣泛。而N-磷酸化由于不穩定導致其檢測極具挑戰性。加之，催化N-磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的缺乏進一步限制了它的研究。其他兩類磷酸化（S-磷酸化和酰基磷酸化）的研究報道卻少之又少。
人類基因組中約有500多種激酶和200多種磷酸酶能調控蛋白的磷酸化過程，這使得蛋白磷酸化更為復雜，這些磷酸化相關酶在精細調控生物體的眾多細胞過程中可發揮關鍵作用。
蛋白激酶屬于激酶大家族，是一類磷酸轉移酶，負責將ATP γ位的磷酸基團轉移至底物蛋白質的特定氨基酸，從而使蛋白質磷酸化，進而發揮生理生化功能。
在人類基因組中，大約2%的人源基因編碼518個蛋白激酶。根據其磷酸化的氨基酸殘基不同，蛋白激酶可以分為五大類：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、組氨酸/賴氨酸/精氨酸蛋白激酶、半胱氨酸蛋白激酶和天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶。
蛋白磷酸酶的功能跟蛋白激酶的功能相反，負責磷酸化蛋白的去磷酸化。
目前，大約有226種已知的蛋白磷酸酶。蛋白磷酸酶分為3個家族：磷酸蛋白磷酸酶家族、金屬依賴性蛋白磷酸酶家族和蛋白酪氨酸磷酸酶家族。
蛋白質磷酸化的分析和磷酸化位點的鑒定已成為目前蛋白質組學研究的關注點之一。目前蛋白質磷酸化的檢測方法主要有特異性抗體（如western blot）、p32放射性標記、質譜、化學生物相結合、核磁共振等。每種方法有其各自的優缺點（表2），研究人員可根據實驗設計挑選合適的檢測方法。
定點突變可以隨心所欲地改變已知DNA序列中的堿基。在基礎研究中，科研工作者通常需要通過改變DNA序列獲得突變基因，以研究基因結構與功能之間的關系；或者通過改變氨基酸序列獲得突變蛋白，以研究蛋白質結構和功能的關系，從微觀水平闡明生理狀態下基因的調控機理、疾病的病因和發病機制。在磷酸化蛋白的研究中，構建模擬磷酸化和非磷酸化的突變實驗是研究磷酸化功能效應的一種常用方法。
磷酸化定點突變實驗的第一步首先要查找磷酸化位點。我們以常用的蛋白數據庫UniProt為例說明，具體步驟如下：
（1）通過//www.uniprot.org/鏈接進入UniProt官網，進入如下主界面：
（2）以人源p53蛋白為例，在Search欄（見上圖紅色標記位置）中輸入p53，進入如下界面：
（3）點擊人源p53蛋白在數據庫中的編號“Q04637”（上圖紅色箭頭所示），查看專家注釋。這里重點介紹“PTM/Processing”。點擊下圖左邊紅色箭頭指向的“PTM/Processing”欄查看分子加工、氨基酸修飾、翻譯后修飾、蛋白組學數據庫、翻譯后修飾數據庫和參考文獻。
（4）假如我們對15位的磷酸化位點修飾，點擊紅色圈中的15即可查看對應的氨基酸序列（見下圖，黃色標記的“S”）。
（5）接下來，我們返回上一頁面，點擊數據庫中的“Names & Taxonomy”選項查找該基因的mRNA序列，點擊藍色標記的基因名即可查閱該基因的詳細信息。
（6）p53的mRNA序列查找可點擊黃色箭頭處獲取：
1）表征磷酸化修飾的突變氨基酸
通過第2部分磷酸化類型的介紹，我們知道Ser、Thr和Tyr殘基上的磷酸化較常見，特別是Ser。根據文獻報道，表征這3種磷酸化修飾的定點突變見表3：
2）表征磷酸化修飾的原理
蛋白質的磷酸化導致磷酸基團受體氨基酸殘基上增加了凈負電荷（pSer，pThr和pTyr帶2個負電荷【見上述圖2】）。而取代的酸性氨基酸（Glu和Asp）的負電荷側鏈在一定程度上模擬了蛋白質中磷酸基團的添加，且長度相似。為了使得實驗結果準確，除了構建模擬磷酸化的突變體外，模擬非磷酸化的點突變構建也是必需的，即磷酸基團受體氨基酸殘基被一個不帶電的和不能磷酸化的氨基酸殘基所取代。目前，Ala和Phe已成功模擬非磷酸化。
3）如何選擇表征磷酸化修飾的突變氨基酸？
表征磷酸化修飾的突變氨基酸選擇主要從氨基酸的長度、大小、電荷和結構方面選擇。例如，與磷酸化的氨基酸殘基相比，Glu或Asp除了帶1個負電荷外，還可能占據更小或不同的空間。因此，在許多情況下，Glu可能比更小的Ala能更好地模擬pSer。但是，注意不是所有情況，這2種氨基酸均已成功模擬pSer。再比如，對于非磷酸化的模擬，Ala經常被作為取代的氨基酸殘基。但是，對于非磷酸化的Tyr，Phe可能是一個更好的的選擇。
2018年10月，浙江大學醫學院劉教授課題組在Molecular Cell(IF=15.584)雜志發表了題為“mTORC1-Regulated and HUWE1-Mediated WIPI2 Degradation Controls Autophagy Flux”研究論文，該論文從采用質譜確定WIPI2新的互作蛋白出發，經體內外實驗發現mTORC1 & WIPI2 &HUWE1三者之間的調控關系、功能效應、生物效應和生理功能：WIPI2是mTORC1新的磷酸化底物。mTORC1通過磷酸化WIPI2，促進WIPI2與其E3泛素連接酶HUWE1的相互作用，導致WIPI2的泛素化和經蛋白酶體的降解，最終抑制自噬，調控模型示意圖見圖3。
在這里，我們重點展示作者體內生理功能的科研成果，這部分研究涉及到模擬磷酸化和非磷酸化突變體的構建，而且非常榮幸的是，本部分研究所用AAV產品由維真生物助力。首先，作者饑餓處理小鼠12h&24h，通過Western Blot發現肝臟中的WIPI2蛋白量增加，而磷酸化的WIPI2卻減少。為了獲得WIPI2磷酸化調控小鼠肝自噬的直接證據，作者使用rAAV-WIPI2, rAAV-WIPI2-S395A, or rAAV-WIPI2-S395D腹腔注射小鼠，4周后發現WIPI2-S395A蛋白量增加，而WIPI2-S395D卻減少；而且，與WT-WIPI2相比，WIPI2-S395A而不是WIPI2-S395D明顯降低了P62和NBR1的蛋白量。此外，腹腔注射rAAV-shHUWE1的小鼠LC3 puncta、WIPI2的蛋白量和P62&NRB1的降解均表現出了增加（圖4）。
幾乎在同一時間，香港浸會大學的張老師課題組在Cell Death Discov(IF=4.114)雜志發表了題為“Oleanolic acid enhances neural stem cell migration, proliferation, and differentiation in vitro by inhibiting GSK3βactivity”研究論文，揭示了齊墩果酸(OA)通過抑制GSK3β活性促進神經干細胞的遷移、增殖和分化，此項工作成果對于治療神經退行性疾病具有重要的意義。
首先，作者通過神經球形成實驗證明OA增加NSCs的遷移；通過CCK-8實驗和神經球形成實驗證實了OA促進NSCs的增殖；通過western blot和免疫熒光實驗揭示了OA促進NSCs分化為神經元。接著，作者通過分子對接表明GSK3β是OA作用的直接靶基因。最后，作者通過western blot和構建非磷酸化突變體（維真生物助力腺病毒）揭示了本論文主題，實驗結果見圖5。
維真生物已建成了18000余種人源基因的現貨克隆庫與12000余種人源基因的腺病毒庫，并有蛋白激酶與磷酸酶的克隆子庫，可為您提供蛋白質磷酸化相關基因的克隆與腺病毒；我們還建成了靶向13000余種小鼠基因的gRNA pool 克隆庫，同樣地，我們也有蛋白磷酸化相關基因的gRNA pool克隆子庫，您可直接包裝AAV，搭配spCas9的轉基因小鼠，完成基因在體內的精準調控，所以如果您有基因喪失方向的實驗需求，這款產品將是您的理想選擇！此外，我們還有靶向700余種人源激酶的gRNA慢病毒文庫，配合CAS9慢病毒或CAS9穩定細胞系，可實現快速高通量地篩選。不僅如此，我們還可以根據您的實驗需求進行磷酸化相關基因的定點突變，并為您提供下游的病毒包裝和基因檢測服務等。
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