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拒絕“肝”擾 ‖ EPHB2有望成為肝細胞癌治療新靶點

近日，香港理工大學李建華教授團隊通過建立索拉非尼耐藥的HCC（肝細胞癌）患者源性的腫瘤異種移植模型(PDTXs)，探究HCC對索拉非尼的獲得性耐藥機制，發現EPHB2激酶在其中起到極其關鍵的作用，該研究確定了一個EPHB2/β-catenin/TCF1的正反饋環，可調節肝癌的腫瘤干性和對索拉非尼的耐藥性，提示靶向該反饋環可能是對抗HCC獲得性耐藥的一種可行的治療策略。

研究背景

 肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球常見的惡性腫瘤之一，晚期患者居多且治療效果差、復發率高。2007年索拉非尼獲得FDA批準，成為HCC第一種全身性治療藥物，改善了HCC晚期患者的生存率。然而，由于HCC對索拉非尼的耐藥性，生存率并不是十分樂觀。因此，深入了解HCC對索拉非尼的耐藥機制尤為重要。先前的研究證明，對索拉非尼耐藥的HCC中腫瘤干細胞（CSC）的干細胞特性會增強，靶向介導肝CSCs特性的信號通路可能是逆轉HCC耐藥的一種策略。

研究思路

首先，研究者通過建立對索拉非尼耐藥的HCC患者源性的腫瘤異種移植模型(PDTXs)，確定了研究靶點——耐藥肝癌細胞系中上調最顯著的激酶EPHB2。經測序及定量分析發現，肝臟CSCs標志物在PDTXs中顯著上調，且肝癌組織中EPHB2的表達明顯高于正常及肝纖維化組織，提示EPHB2的致癌性。為研究EPHB2在肝癌中的促腫瘤作用，研究者在免疫活性小鼠中進行內源EPHB2的敲除，發現內源性EPHB2敲除后腫瘤結節的大小和數量顯著減少，且小鼠的存活時間更長。然后研究者進行了EPHB2過表達和敲除，證實EPHB2表達升高促進了成瘤，肝臟CSCs的標志物表達增加，藥物處理效果較差，而敲除EPHB2后得到與上述相反的結果。接著，研究者探尋上下游效應因子，通過一系列體內外實驗，最終確定了一個可以調節腫瘤干性與耐藥性的EPHB2/β-catenin/TCF1正反饋環。

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部分研究結果

 該篇研究之初，研究者證實了EPHB2在索拉非尼耐藥的HCC細胞中表達升高，并有促腫瘤的作用，能促進HCC腫瘤生長，參與調節肝細胞癌的CSC特性和耐藥性。那么，EPHB2的下游效應因子是什么，其發揮作用的機制又是如何？研究者馬上又進行了下一步的探討。

RNA測序分析顯示HCC腫瘤細胞（PLC/PRF/5）中EPHB2表達降低后，Wnt/β-catenin信號通路中60%以上的相關基因發生了顯著改變。為證實這一點，研究者探究了EPHB2突變對β-catenin反式激活活性的影響，發現當EPHB2被抑制時，β-catenin的反式激活活性被抑制且蛋白表達量降低，EPHB2過表達的細胞則相反。此外，免疫沉淀發現，EPHB2能磷酸化SRC激酶，當EPHB2被過表達或抑制時，SRC的磷酸化會發生改變，進而導致AKT/GSK3β/β-catenin信號通路的變化。此外，TCGA分析結果也顯示Wnt/β-catenin信號通路是EPHB2高表達的HCC患者中唯一顯著富集的通路。以上結果共同證實，Wnt/β-catenin是EPHB2的主要信號因子。

圖1. Wnt/β-catenin是HCC肝癌中EPHB2信號的下游效應因子

 已知在結直腸癌中EPHB2是Wnt的靶基因，但具體調節機制尚不清楚。研究者通過體內外實驗激活Wnt/β-catenin通路，發現EPHB2的表達水平均呈現持續上調，推測Wnt/β-catenin在轉錄水平激活了EPHB2的表達，后通過生物信息學的方法預測到EPHB2上游存在一個可能的TCF1（T細胞因子）結合位點，β-catenin可入核與TCF1結合促進EPHB2的轉錄表達，形成一個正反饋回路。

圖2.EPHB2/β-catenin/TCF1正反饋通路調節肝細胞癌的CSC和耐藥性

最后，研究者通過敲低EPHB2表達并聯合索拉非尼探究EPHB2體內治療的靶向性。在NRAS/ akt誘導肝癌小鼠模型兩周后，通過靜脈注射rAAV8-shEPHB2（維真生物榮幸提供）抑制EPHB2的表達，并在一周后給予小鼠30mg /kg的索拉非尼治療21天（DMSO作為對照藥物）。通過計算實驗組與對照組小鼠的肝重/體重比，研究者發現rAAV8- shEPHB2聯合索拉非尼對腫瘤生長有明顯的抑制作用，說明降低EPHB2表達并聯合索拉非尼協同治療能有效抑制體內HCC的發生。

圖3.敲低EPHB2可增強HCC細胞對索拉非尼的敏感性

小結

 綜上所述，該研究證明EPHB2通過TCF1/EPHB2/β-catenin正反饋環來調節腫瘤的干性和耐藥性。靶向EPHB2或與其他靶點聯合治療肝癌可能是一種新的治療策略。