Nat Commun：南方醫科大學高天明教授團隊揭示星形膠質細胞來源的ATP調控自閉癥的作用機制

 近日，南方醫科大學高天明教授帶領團隊在Nature Communications（IF=14.919）上發表了題為“Impaired calcium signaling in astrocytes modulates autism spectrum disorder-like behaviors in mice”的文章，揭示了內側前額葉皮質（mPFC）腦區星形膠質細胞中的ATP通過P2X2受體調控小鼠的自閉癥（ASD）樣行為，證實了ATP在ASD的病理生理過程中發揮的潛在作用。

維真生物為本研究助力

病毒產品：AAV8-GFAP-hM3Dq-mCherry & AAV9-GfaABC1D-ATP1.0

研究背景

 自閉癥譜系障礙（Autism spectrum disorder,ASD）是一種較為嚴重的廣泛性發展障礙疾病，常起病于嬰幼兒期，一般有社交障礙、溝通困難、刻板行為和興趣狹隘等癥狀。根據WHO發布的報告，全球每160名兒童中就有1名患自閉癥。然而，截止目前ASD的發病機制仍是未解難題。

 已有研究表明，在ASD患者和動物模型中觀察到了星形膠質細胞的改變，但是星形膠質細胞功能障礙與ASD樣表型的因果關系尚不清楚。已知星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的細胞類型，參與許多重要的腦功能，其激活主要表現為三磷酸肌醇2型受體(IP3R2)介導的細胞質鈣信號的增加。先前研究表明，IP3R2基因突變與ASD相關，敲除IP3R2后星形膠質細胞出現功能障礙。然而，IP3R2缺陷引起的星形膠質細胞功能障礙是否與ASD的發生有關尚不清楚。

研究思路

 首先，研究者利用IP3R2 KO（IP3R2全身敲除）和IP3R2 cKO小鼠（星形膠質細胞IP3R2特異性敲除）模型，通過雙光子鈣成像、多項自閉癥行為測試及病毒學手段等發現IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠均表現出星形膠質細胞鈣信號異常及明顯的社交障礙、重復刻板等ASD樣癥狀，這說明星形膠質細胞功能異常參與了ASD樣行為。通過微透析、新型ATP探針使用及外源給藥等方法發現IP3R2突變小鼠星形膠質細胞胞外ATP水平降低，而ATP給藥能夠改善小鼠自閉癥行為，確定了星形膠質細胞ATP釋放異常與ASD發生有關。最后，通過電生理、基因表達干擾等手段明確了ATP通過P2X2受體調控GABA能突觸傳遞及ASD樣行為。該研究闡述了星形膠質細胞在ASD樣行為發病機制中發揮的關鍵作用，并確定了星形膠質細胞來源的ATP在ASD中的潛在分子角色。

部分研究結果

1、IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠均表現出ASD樣行為

 首先，研究者制備了IP3R2缺失的IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠模型，通過雙光子顯微鏡成像觀察發現兩種小鼠體內的Ca2+信號均發生異常，說明IP3R2的表達缺失影響了Ca2+的正常釋放。通過對IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠進行自閉癥相關的行為學測試（三箱社交偏好實驗、理毛實驗及埋珠實驗），研究者發現兩種小鼠均表現出明顯的社交障礙和重復行為，而這兩種癥狀正是自閉癥的核心表型。此外，已知mPFC腦區是ASD患者功能受損的關鍵腦區，在生理和病理條件下與社會行為密切相關，研究人員通過RNA干擾技術特異性敲低mPFC腦區星形膠質細胞的IP3R2，發現能夠引起小鼠產生明顯的社交障礙。以上結果表明，mPFC星形膠質細胞中IP3R2的缺失導致了小鼠的ASD樣行為。

2、IP3R2 KO小鼠星形膠質細胞中ATP水平降低

接著，研究人員分析了mPFC中星形膠質細胞分泌的遞質水平變化，以此研究IP3R2突變小鼠產生自閉癥相關表型的神經生物學機制。體內微透析實驗顯示IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠ATP水平均顯著降低，且IP3R2 KO小鼠分離的星形膠質細胞的培養液中ATP濃度也有顯著降低，這說明星形膠質細胞中IP3R2的缺失造成了ATP水平的特異性降低。通過進一步研究發現細胞外ATP水平降低，總ATP及胞內ATP水平并未發生變化。作者猜測這可能是由于ATP釋放減少或細胞外核苷酶降解ATP增加引起。為闡明這一假設，研究人員在mPFC星形膠質細胞中特異性表達了AAV8-GFAP::hM3Dq-mcherry和AAV9-GfaABC1D::ATP1.0（維真生物提供），前者用于星形膠質細胞的特定激活，后者用于星形膠質細胞中ATP釋放的實時監測。發現與WT小鼠相比，IP3R2 KO小鼠的ATP釋放明顯降低，說明細胞外ATP水平的降低可能是由于ATP釋放的降低。通過篩選多種細胞外ATP酶的mRNA水平及使用ATP酶抑制劑，進一步明確了胞外ATP酶活性增強也可能是胞外ATP水平降低的原因。這些數據表明，ATP釋放減少和水解增加可能共同降低了IP3R2突變小鼠胞外的ATP水平。

3、ATP給藥可改善IP3R2突變小鼠ASD樣行為

 為檢驗ATP降低是否與IP3R2突變小鼠的ASD表型有關，研究者對IP3R2突變小鼠進行ATP的腹腔注射。發現補充ATP后IP3R2 KO小鼠和IP3R2 cKO小鼠的社交障礙得到部分緩解，提示IP3R2突變小鼠星形膠質細胞ATP缺乏和社會損傷之間存在因果聯系。為了確定mPFC中星形膠質細胞ATP的減少是否導致IP3R2突變小鼠的社會功能障礙，研究者在mPFC區注射ATPγS，得到的結果與上述結果一致，這表明mPFC腦區是IP3R2突變小鼠社交障礙的潛在位點。

4、ATP給藥可恢復IP3R2突變小鼠受損的GABA能神經傳遞

 將自閉癥動物模型ASD樣行為的可逆性與ASD突觸理論結合，研究者猜測持續的突觸病變可能是ASD的潛在原因。為驗證這一假設，研究者比較了WT與IP3R2 突變鼠mPFC中神經元的電生理特性。電生理實驗顯示與WT組小鼠相比，IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠mPFC腦區錐體神經元GABA能輸入減少而谷氨酸能神經傳遞不受影響。而GABAAR激動劑氯硝西泮的給藥明顯改善了IP3R2 敲除小鼠的社交功能障礙，進一步說明GABA能傳遞減弱可能是IP3R2突變小鼠自閉癥樣表型的基礎。為檢測IP3R2突變小鼠GABA能傳遞受損是否是由星形膠質細胞ATP的減少所引起，研究者測試了ATPγS的拯救作用，發現注射ATPγS可以逆轉上述現象。結合以上數據，星形膠質細胞中IP3R2缺失造成的ATP水平降低導致了GABA能突觸功能障礙，可能是ASD樣行為發生的基礎，通過ATP治療可使其恢復正常化。

5、mPFC腦區P2X2受體介導ATP對ASD樣行為的調控

 已有研究表明ATP通過P2X2R調控GABA能突觸傳遞。研究者通過RNA干擾沉默IP3R2 cKO和對照組小鼠mPFC中的P2X2R，發現沉默P2X2R，不僅能使WT小鼠表現出明顯的社交障礙，損害GABA能神經元傳遞，也阻斷了ATP及ATPγS在治療IP3R2 cKO小鼠自閉癥和增加sIPSC頻率的作用。綜上所述，mPFC中的P2X2受體對于ATP的抗自閉癥作用是必需的，并通過增強GABA能突觸傳遞介導ATP對ASD樣行為的調控。

結論及意義

 該研究首次報道了星形膠質細胞功能障礙與ASD的發生存在直接聯系：星形膠質細胞中IP3R2基因的表達缺失造成胞外ATP水平的下降，進而通過P2X2受體調控GABA能突觸傳遞減弱，導致ASD的發生。而自閉癥與抑郁癥高度共病，結合該團隊之前的報道-星形膠質細胞來源的ATP介導抑郁癥的發生（Cao et al., Nat Med 2013），可能存在共同的病理生理機制，這一研究有望為二者的臨床治療提供有效策略。

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