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Protein&Cell｜浙大夏宏光教授課題組揭示二甲雙胍治療阿爾茨海默病新機制

近期，浙大夏宏光教授課題組在《Protein&Cell》（IF=14.971）上發表了題為“Metformin activates chaperone-mediated autophagy and improves disease pathologies in an Alzheimer disease mouse model”的研究成果，文章首次描述了二甲雙胍誘導CMA（分子伴侶介導的自噬）的機制，即通過激活TAK1-IKKα/β信號通路，使熱休克蛋白Hsc70 Ser85發生磷酸化并被激活從而調控CMA進程。本研究發現APP是CMA的底物，能以IKKα/β依賴的方式與Hsc70結合，抑制CMA介導的APP降解能增強細胞毒性。此外，在APP/PS1 AD小鼠模型中，Hsc70過表達或二甲雙胍激活CMA可以有效降低腦區Aβ斑塊積累水平，并逆轉AD的分子和行為表型。該研究確定了二甲雙胍可作為CMA的新型激活劑，并可作為治療AD的有效藥物，同時也為治療CMA相關疾病提出了一種有利證據。

二甲雙胍誘導CMA的激活機制

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1. 研究背景

阿爾茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)是一種常見的神經退行性疾病，臨床表現為進行性認知功能障礙和記憶力減退等，其病理特征包括Aβ蛋白沉積和Tau蛋白過度磷酸化。已知Aβ蛋白來源于淀粉樣前體蛋白(APP)，CMA激活能夠降低Tau蛋白水平，因此利用藥物促進APP的清除，并尋找安全有效的CMA激活藥物，可能是治療AD的潛在策略。然而CMA在調節Aβ蛋白水平中的作用尚未被證實，此外，目前也缺乏一種能安全有效激活CMA的藥物，阻礙了通過CMA激活策略治療相關疾病可行性的研究。二甲雙胍是一種廣泛用于治療2型糖尿病的口服藥物，安全性高，研究表明二甲雙胍不僅對一些癌癥具有有益作用，還可以抑制慢性炎癥、抗衰老，并可能保護認知功能。但是二甲雙胍是否可用于阿爾茨海默病的有效治療，目前尚不明確。

2. 研究思路

 首先，本研究通過藥物篩選確認二甲雙胍是一種新型的CMA激活劑，可以激活IKKα/β激酶，進而磷酸化并激活Hsc70。此外，作者通過體內實驗發現，二甲雙胍能降低APP/PS1的AD小鼠模型中Aβ水平，進而改善小鼠的認知障礙。最后，作者利用AAV載體介導Hsc70在APP/PS1的AD小鼠海馬區的過表達，發現Hsc70過表達能夠顯著減輕AD的病理過程。

3. 研究結果分享

1. 二甲雙胍激活CMA

 首先，研究者利用293THK細胞（監測CMA活性的功能性報告系統）和高通量流式細胞術篩選了能有效激活CMA的藥物。在2197種FDA批準的藥物或候選藥物中，篩選出了廣泛用于治療2型糖尿病的藥物二甲雙胍，二甲雙胍在Lamp2a（溶酶體受體，介導CMA底物進入溶酶體）正常表達情況下能誘導HK2-GFP水平下降，而在Lamp2a敲低時則不能。

 用二甲雙胍處理293THK細胞后，HK2-GFP蛋白水平下降，并呈現一定的劑量依賴性，而下調Hsc70表達則逆轉了二甲雙胍對HK2-GFP的影響。此外，二甲雙胍還能誘導兩種內源性CMA底物HK2和PKM2的降解，并可被溶酶體抑制劑（如E-64D，BafA等）而非蛋白酶抑制劑所抑制，證明此降解過程依賴于溶酶體。而Hsc70和Lamp2a的敲低阻斷了二甲雙胍誘導的內源性HK2和PKM2的降解，pull-down和PLA技術均證實二甲雙胍誘導內源性HK2和PKM2與Hsc70 和 Lamp2a相互作用，此外還排除了宏自噬在此過程中的作用，證實這些蛋白的降解依賴于CMA。

 上述研究結果表明，二甲雙胍能夠以溶酶體、Hsc70和Lamp2a依賴的方式激活CMA，觸發其底物的降解，并促進它們與Hsc70和LAMP2A的相互作用。

圖1. 二甲雙胍激活CMA

2. 二甲雙胍通過Hsc70的Ser85磷酸化激活CMA

 研究者發現，二甲雙胍誘導的HK2-GFP熒光和蛋白水平的降低可以通過過表達λ-磷酸酶來挽救，這表明磷酸化是導致HK2-GFP降解的原因。通過對二甲雙胍處理的細胞Hsc70-Flag免疫沉淀進行質譜磷酸化分析，發現二甲雙胍可誘導Hsc70第85位絲氨酸發生磷酸化，其非磷酸化突變體Hsc70-S85A可顯著降低二甲雙胍誘導的Hsc70與CMA底物蛋白之間的相互作用。過表達Hsc70-WT而非Hsc70-S85A可降低CMA底物HK2和PKM2的蛋白水平，而敲低Lamp2a可以阻止此降解反應。這些結果表明，二甲雙胍通過Hsc70 Ser85磷酸化激活CMA，促進Hsc70與CMA底物蛋白的相互作用。

圖2. 二甲雙胍通過Hsc70的Ser85磷酸化激活CMA

3. 二甲雙胍激活TAK1-IKKα/β信號通路，進而磷酸化Hsc70 Ser85

與二甲雙胍誘導的CMA活化與AMPK無關一致，Hsc70 Ser85位點的磷酸化也與AMPK激活無關，研究者發現Hsc70 Ser85是IKKα/β的預測潛在靶點。體外激酶檢測實驗顯示Hsc70的Ser85位點能被IKKα和IKKβ直接磷酸化，且IKKα和IKKβ的結合進一步加強了磷酸化。二甲雙胍處理后，IKKα或IKKβ與Hsc70的相互作用增加，這表明IKKα/β在Ser85處磷酸Hsc70。敲低293THK細胞中的IKKα和IKKβ再用二甲雙胍處理，發現IKKα/β敲低可以降低p-Hsc70 Ser85水平并阻止內源性HK2和PKM2的降解，挽救二甲雙胍誘導的HK2-GFP熒光和蛋白質水平的降低，二者過表達則增加了p-Hsc70 Ser85水平，這些結果進一步證明，Hsc70 Ser85磷酸化的上游激酶是IKKα/β。

已知TAK1（轉化生長因子β激活激酶1）能磷酸化并激活IKKα/β激酶，由此研究者驗證了二甲雙胍誘導的IKK和CMA激活是否依賴于TAK1。研究者發現，下調TAK1挽救了二甲雙胍誘導的HK2-GFP水平下降、內源性HK2和PKM2的降解以及IKKα/β、Hsc70 Ser85的磷酸化，這說明二甲雙胍可激活TAK1，進而磷酸化并激活IKKα/β， IKKα/β再磷酸化Hsc70誘導CMA的激活。體外熱位移法檢測證明二甲雙胍與TAK1之間沒有直接的相互作用，即TAK1不是二甲雙胍的直接靶點，但它參與了二甲雙胍誘導的CMA激活。

圖3. 二甲雙胍激活TAK1-IKKα/β信號通路

4. APP是CMA的底物

隨后，研究者研究了二甲雙胍激活CMA后APP是否可以被靶向降解，發現甲雙胍以溶酶體、Hsc70和LAMP2A依賴的方式誘導SH-SY5Y細胞內源性APP蛋白的降解。同時，也增強了內源APP與Hsc70-Flag以及LAMP2A-Flag之間的相互作用，且Hsc70-Flag與APP的相互作用能被Hsc70的S85A突變所阻斷。值得注意的是，抑制IKKβ和TAK1的表達可以阻斷二甲雙胍誘導的APP降解，同時阻斷Hsc70（Ser85）和IKKα/β（Ser176/180）的磷酸化。這些結果表明，APP是CMA的底物，二甲雙胍可以通過激活TAK1-IKKα/β-Hsc70-CMA途徑來誘導其降解。

圖4. 二甲雙胍通過激活CMA誘導APP降解

5. 二甲雙胍激活CMA或Hsc70過表達可改善APP/PS1小鼠認知功能缺陷

 經過探究研究者發現，二甲雙胍誘導的CMA激活可以誘導APP降解并減輕APP和Aβ的細胞毒性作用。接著，研究者又對APP/PS1小鼠進行了行為學實驗，探索了二甲雙胍誘導的CMA活化對小鼠記憶喪失及AD相關分子標志物的影響，發現二甲雙胍處理后，APP/PS1小鼠的學習和空間記憶得到了明顯改善，整個大腦中不溶性Aβ1-42水平顯著下降，海馬中Aβ斑塊水平下降。GFAP染色發現，二甲雙胍處理后海馬星形膠質細胞的激活也有所降低。此外，與體外實驗結果一致，二甲雙胍處理也顯著降低了APP蛋白水平，并誘導了Hsc70 Ser85位點的磷酸化。

為驗證Hsc70過表達激活CMA是否也可以緩解APP/PS1表型，研究者利用AAV在小鼠的海馬區對Hsc70 WT和Hsc70-S85A進行了過表達。發現Hsc70 WT過表達減輕了APP/PS1小鼠的認知缺陷，并且有效降低了APP/PS1小鼠腦組織中不溶性Aβ1-42水平及其海馬區Aβ斑塊水平和APP蛋白水平。這一結果表明，通過二甲雙胍或過表達Hsc70激活CMA可降低不溶性Aβ1-42積累、Aβ斑塊水平，誘導APP降解，從而緩解APP/PS1小鼠的認知缺陷。

圖5. 二甲雙胍激活CMA有效緩解阿爾茨海默病小鼠的認知缺陷

4. 小結

 綜上所述，該研究發現降糖藥物二甲雙胍可作為CMA的激活劑，同時也證實了APP是CMA的底物，二甲雙胍可以通過激活TAK1-IKKα/β-Hsc70-CMA途徑來誘導其降解，進而改善AD小鼠的認知缺陷；除了作為治療2型糖尿病的臨床藥物，二甲雙胍也初次被證實具有用于治療AD疾病的可行性。總之，該研究揭示了二甲雙胍通過激活分子伴侶介導自噬治療 AD 的新機制，為AD等相關退行性神經疾病的治療提供了一種潛在的治療策略。

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