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近期，北京大學劉濤教授課題組在Molecular Cell （IF=17.970）上發表了題為“Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates”的研究論文，文章報道了利用生物正交化學方法，將位點特異性修飾的Cas12a蛋白和5’端化學修飾的crRNA生成共價Cas12a-crRNA復合物（cCas12a），不僅提高了Cas12a系統在哺乳動物細胞中的基因組編輯效率，還能夠用于CAR-T細胞制備中的精確基因敲入和多重基因編輯。本研究為Cas12a系統的廣泛應用奠定了基礎，同時也為改造其它低效的Cas家族成員提供了潛在思路。
CRISPR/Cas系統已被廣泛用于哺乳動物等多個物種的基因組編輯。哺乳動物細胞基因編輯中常用的Cas酶除了熟知的Cas9蛋白外，還有V型Cas12a蛋白。區別于Cas9蛋白，Cas12a具有以下特點：①只需單個crRNA，且體積更小、更易被遞送至細胞中；②Cas12a切割后產生粘性末端，更利于基因組精確編輯；③識別的PAM序列（TTTN）不一致；④Cas12a的切割位點遠離其識別位點，為連續多次編輯提供了可能性；⑤脫靶率相對較低。這些特點使CRISPR/Cas12a系統成為臨床應用中的一種潛在更安全的選擇。然而，CRISPR/Cas12a系統也存在局限性—基因編輯效率相對低下，這一點大大限制了該系統在生物醫藥領域的應用。研究報道，Cas12a核酸酶只能與一種約42nt的crRNA結合，且二者親和力較弱。研究者推測CRISPR/Cas12a系統的低編輯效率可能與Cas12a和crRNA的弱結合力有關,增強二者間的相互作用可能是提高該系統編輯效率的突破口。
針對Cas12a和crRNA的弱結合力問題，研究人員提出了Cas12a與crRNA共價交聯的策略，通過基因密碼子擴展技術在Cas12a核酸酶上定點引入了含有疊氮基團的非天然氨基酸，結合蛋白晶體結構分析，得到位點特異性修飾的Cas12a蛋白，并與5’端DBCO（二苯并環辛炔）修飾的crRNA共價偶聯，生成了有活性的核糖核蛋白復合物（RNP）。此策略將Cas12a和crRNA共價連接成一個組分，RNP復合物可以直接傳遞到細胞中，在到達目標位點之前共價鍵還可以防止復合物解離，安全性及準確性均較高。
研究表明，Cas12a crRNA的5’端經修飾后活性不會受影響，由此研究人員嘗試將crRNA的5’端與Cas12a共價結合。首先確定了合適的交聯位點為AsCas12a（來自氨基酸球菌屬）蛋白的第806位甲硫氨酸（M806）,并通過非典型氨基酸誘變技術將其替換為含疊氮基團的非天然氨基酸AeF，生成了突變體AzCas12a。經體外DNA切割等實驗檢測證實AzCas12a與WT Cas12a具有相同的的核酸酶活性。隨后，研究人員將5’DBCO修飾的crRNA通過疊氮-炔環加成反應共價連接到AzCas12a，生成了cCas12a RNP復合物。體外DNA切割試驗證實了cCas12a RNP復合物的核酸酶活性。
cCas12a RNP復合物生成后，研究人員對其切割效率進行了驗證：在HEK293-EGFP- Teton細胞中，cCas12a RNP對EGFP基因的編輯效率約是WT Cas12a和非共軛AzCas12a的3倍，而對HEK293細胞中5個內源性基因位點的編輯效率提高了1.6-18.3倍；在3種難轉染細胞（K562、Jurkat和NIH/3T3）中,cCas12a RNP對相關基因的編輯效率也大大提高（2~4倍）。這說明，Cas12a與crRNA共價交聯可以大幅提高不同細胞中不同位點的基因編輯效率。
接下來，研究人員對CRISPR/cCas12a的脫靶效率進行了評估。首先，使用GUIDE-seq方法評估了cCas12a和WT Cas12a RNPs對HEK293細胞中三個不同基因位點（hHPRT1、GUK1和DNMT1）的靶效率和脫靶效率。結果表明，cCas12a對3個基因的打靶率增加了2-6倍。此外，cCas12a對hHPRT1和GUK1基因的脫靶切割未檢測到。對于本身脫靶率極高的DNMT1基因，研究人員也確實檢測到了cCas12a對DNMT1的非靶向切割。這些數據表明，cCas12a RNP復合物可以大幅提高基因的靶上編輯效率，而脫靶效應的風險可能取決于crRNA的內在序列特異性。
除了可將AsCas12a與crRNA共價交聯外，研究人員還將此共價交聯策略成功應用于其它Cas12a家族蛋白——LbCas12a（來自毛螺菌科細菌），同樣地，選擇了合適的交聯位點H759，將其突變為H759AeF，并與修飾的crRNA共價交聯，生成LbCas12a RNP復合物。體外實驗檢測發現LbCas12a RNP對基因的切割效率為WT LbCas12a的1.7倍，證實了共價交聯策略也可用于其他Cas12a家族成員。此外，研究人員進一步探索發現此共價交聯策略還可應用于其它現有的Cas12a突變體及基于Cas12a的堿基編輯器（見原文補充結果3）。
已知Cas12a的切割位點遠離其識別位點，在插入/缺失形成后的目標位點上提供額外的切割機會，增加了HDR介導的基因整合機會。因此作者探究了cCas12a RNP是否也能提高HDR效率，將cCas12a RNP和靶向hHPRT1基因的帶有EcoRI識別位點的單鏈供體DNA電轉入HEK293細胞。檢測發現，cCas12a RNPs的HDR效率是WT Cas12a的7-8倍，證實了CRISPR/cCas12a可以提高哺乳動物細胞中基于Cas12a的HDR效率。
CAR-T細胞免疫療法是目前極具前景的腫瘤治療方式之一，基因編輯技術的應用有望改善當前和發展中的CAR-T細胞免疫治療策略。研究報道，Cas12a結合AAV載體遞送策略制備的CAR-T細胞效率更高。那么，cCas12a平臺是否可以用于CAR-T細胞的制備呢？對此研究人員進行了探究。將WT Cas12a和cCas12a RNP電擊導入人原代T細胞，對內源性TRAC基因進行定點敲除，隨后用 AAV6-CD19 CAR（維真生物包裝助力）感染T細胞，使CAR基因定點重組至TRAC基因座中。流式檢測CAR敲入效率，結果顯示cCas12a對CAR的敲入效率是WT Cas12a的近2倍。對WT Cas12a和cCas12a制備的CAR陽性細胞免疫學特性分析顯示，cCas12a制備的CAR-T細胞免疫特性與WT Cas12a相同。上述結果表明，cCas12a系統提高了CAR-T細胞的制備效率，并且T細胞經cCas12a處理后的免疫特性與WT Cas12a系統相同，表明cCas12a系統在T細胞工程中具有潛在的應用價值。
目前臨床上多使用自體T細胞進行CAR-T細胞免疫治療，但受自體T細胞質量、數量及時間和成本等因素的限制，基于CRISPR系統制備通用CAR-T細胞可以避免這些限制。研究人員利用cCas12a進行了T細胞中多重基因編輯，同時敲除了內源性TRAC, β-2微球蛋白 (β2M), PD1與CTLA4基因，同時在TRAC位點定點敲入了CAR基因，制備了通用型CAR-T細胞。多重基因敲除效果檢測顯示無論是同時敲除雙基因、三基因還是四基因，與WT Cas12a系統相比，cCas12a系統的多基因編輯效率均更高，證實cCas12a可以進行高效地多重基因組編輯，用于制備通用CAR-T細胞。
綜上所述，研究人員利用共價交聯策略生成的Cas12a蛋白與crRNA的復合物cCas12a不僅大幅提高了哺乳動物細胞中基于Cas12a的基因組編輯效率，并且可以應用于CAR-T細胞制備的精確基因整合和多重基因編輯，為高效的哺乳動物細胞工程提供了有用的工具，有望推動新一代更安全可控的免疫細胞制備。
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