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上述如此絢麗多彩的圖片是科學家采用2007年哈佛大學腦科學中心開發的Brainbow（彩虹腦）技術對小鼠海馬齒狀回DG進行多色標記的結果。
Brainbow是一項采用含多色熒光蛋白XFP的重組載體標記大腦的成像技術，其技術精髓就是XFP，技術核心是Cre/Loxp系統。具體來說，在Cre/Loxp系統的刪除或(和)顛倒作用下， 由單個啟動子在一種細胞群中驅動兩到四個XFP隨機表達；多個Brainbow轉基因拷貝的整合誘發這些XFP的組合表達，從而創造出更多的色彩。在神經系統中，由此產生的多色標記可以用來區分相鄰的神經元細胞或膠質細胞，并在追蹤神經環路的同時確定神經元突起的身份，從而幫助科學家解析大腦。
那么，作為Brainbow技術精髓的XFP，大家又了解多少呢？這兩期推文我們將帶領大家深入、全面地了解熒光蛋白。
在正式介紹熒光蛋白之前，我們先來了解幾個光學基本概念：
我們在對樣品進行熒光成像時，首先樣品需要進行熒光標記，其次用某種波長的入射光進行照射，吸收光能后進入激發態，并且立即退激發并發出比入射光波長更長的發射光。在這過程中，用來標記樣品并使其具有發光性質的物質叫熒光物質，而照射樣品的入射光叫激發光，發出來的發射光就叫熒光。
當熒光物質被激發光照射后，激發光的能量就會供給熒光物質，熒光物質吸收能量后發生能級躍遷，即由低能級的基態躍遷至高能級的激發態。而高能級的激發態不穩定，所以會恢復至低能級的基態。在這過程中，熒光物質吸收的能量就會以光的形式進行釋放，從而產生熒光。而事實上，在能量釋放過程中還有一部分是被喪失掉的，因此發射光的能量低于激發光的能量，相對應地，發射光的波長要比激發光的波長長。熒光物質發光的整個過程可用Jablonski能量圖來表示（圖1）。
熒光光譜分為激發光譜和發射光譜兩種：激發光譜是熒光物質在不同波長的激發光作用下記錄的熒光強度隨激發光波長的變化情況；而發射光譜則是在固定波長的激發光作用下記錄的熒光強度隨發射光波長的變化情況。
無論是激發光譜還是發射光譜，記錄的均是熒光強調隨波長的變化情況，不同的是隨誰的波長而變化。電磁波波普將有助于我們了解各波普的波長，從而為我們設計實驗提供理論基礎（圖2）。
接下來我們就正式介紹熒光蛋白：
自1994年GFP首次被用于標記基因后，熒光蛋白（Fluorescent proteins，FPs）就成了生命科學領域中非常重要的細胞成像工具之一。這些FPs借助高分辯率顯微技術能夠幫助我們觀察先前無法看到的生物過程，如活細胞內的代謝過程、信號通路，大腦中的突觸鏈接，癌細胞的擴散等。
在1996年，GFP的晶體結構被科學家成功解析：GFP是典型的β桶形結構，包括11條β折疊和α螺旋：11條β折疊緊密交織在一起形成圓柱狀的“柵欄”，α螺旋上的第65、66、67位氨基酸（絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸）位于其正中位置，在分子氧的作用下，經過環化、脫氫等作用最終形成成熟的熒光基團，嚴密的桶形結構保護著熒光基團，防止它被周圍環境淬滅（圖3a和3b）；N端和C端均暴露在外面。
FPs的種類五花八門，就FPbase中收錄的就831種，幾乎覆蓋了從紫外光到遠紅外光的所有光譜波段。盡管這些FPs的光學特性大相徑庭，但是它們的結構卻極其相似。結構決定功能，人們對FPs結構的深刻認識對于理解其功能及拓展其范圍具有非常重要的理論意義。
面對琳瑯滿目的FPs，研究人員在具體科學研究中往往受到一系列問題的困擾，如哪些FPs好用？哪些FPs亮度高？哪些因素影響理想FPs的選擇？下面我們就從如下幾方面一一展開討論，旨在為大家縮小選擇范圍提供參考。
FP的亮度由多種因素決定，包括FP固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系數、量子產量和光穩定性[長期實驗中]決定）、成像設備的光學特性（照射光的波長和強度，濾光片的光譜和二色鏡）和照相機或人眼對發射光譜的敏感性。雖然這些因素無法從整體上鑒定更亮的FP，但是在各個光譜波段內還是有可能鑒定較亮的FP，因為這主要取決于其固有的光學特性。更亮的FP意味著可以用更低的激發光強度進行成像，從而更好地保護樣品免受光損傷。而且，更亮的FP可以提供檢測和成像所需的足夠信號。下表是各光譜波段推薦的FPs（表1）。
大多數FPs來源于海洋生物，而我們研究的基因大多數來自于哺乳動物。這兩種物種的密碼子偏好性存在較大差異，這種差異很可能會造成FP在哺乳動物表達系統中低表達甚至不表達，進而觀察不到熒光。因此，用于成像實驗的FPs往往都需要根據所表達系統進行密碼子優化，使其能夠很好地表達。慶幸的是，目前我們所使用的FPs已針對哺乳動物的密碼子進行了優化，而且可以很好地表達。FPs需要經歷轉錄、翻譯、折疊、熒光基團形成等步驟形成成熟蛋白后才能發光。雖然，大多數經過密碼子優化的FPs能在哺乳動物系統中很好地表達，但是其折疊效率有快有慢，從而決定了其成熟時間不同。因此，FPs的成熟時間也需考慮在內，在進行目標蛋白亞細胞定位時，我們需要根據其壽命選擇相應的FP。
所有FPs最終都會在長時間的激發光照射下發生光漂白，從而逐漸喪失發光能力，但是其光漂白速率迥異。因此，針對不同的成像實驗，我們需要選擇不同光穩定性的FP：對于需要不多于10張圖片的短期成像實驗，光穩定性通常不是一個主要考慮因素，但在需要大量圖片的長期成像實驗中，選擇極具光穩定性的FP是實驗成功的關鍵。
對于蛋白亞細胞定位實驗，我們在構建熒光融合蛋白時要選擇單體性質的FPs，因為多聚體的FPs很可能會能影響目標蛋白的功能或定位。
大多數FPs具有不同程度的酸敏感性，有的適合在酸性環境下使用，有的適合在堿性環境下使用，因此，在不同酸堿度溶液成像中，我們選擇FPs時還需考慮其PK 值（用于指示FPs的pH敏感性，PK 值越小酸性越強）。在特定條件下，那些對pH敏感的FPs可以指示細胞內酸堿度的變化，例如單標（GFP-LC3B）和雙標（mCherry-GFP-LC3B）自噬指示系統就是利用了GFP和mCherry不同的酸敏感性來追蹤自噬流的。
自GFP被首次用于標記基因后，水母來源的GFP不斷被改造，得到了大量藍色、青色和黃色的衍生物。同時，來自其他物種的FPs也被陸續鑒定，進一步將FPs的顏色拓展至橙色、紅色和紅外光譜區。從FPs被改造的整個過程，我們可以看出，FPs的改造趨向紅移。因為FPs越紅越好，顏色越紅意味著波長越長，對應的激發光波長也更長，長波長光的激發對細胞和組織的光損傷小，且背景自發熒光和動物組織的光吸收都非常小，組織穿透力強（圖4）。這些特征使得紅色FPs更適合于體內深組織成像。
這些五顏六色的FPs為我們選擇FPs進行多色標記實驗提供了豐富的資源。值得注意的是，在選擇FPs顏色的同時還要兼顧它們的兼容性：一個好的經驗法則是，兩種FPs的峰激發波長和峰值發射波長均應相隔50-60nm。
選擇FPs進行成像實驗時，所選FPs的光譜范圍需滿足實驗室現有成像設備的需求，畢竟重新購買成像設備成本還是比較高的。推薦使用的成像設備濾光片組合見表2。
本期先為大家介紹到這里，下一期我們為大家介紹熒光蛋白的應用，敬請期待。
1. Day, R. N. and M. W. Davidson (2009). "The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging." Chem Soc Rev 38(10): 2887-2921.
2. Shaner, N. C., et al. (2005). "A guide to choosing fluorescent proteins." Nat Methods 2(12): 905-909.
3. Keereweer, S., et al. (2013). "Optical image-guided cancer surgery: challenges and limitations." Clin Cancer Res 19(14): 3745-3754.
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