瘋狂打call的甲亢造模工具—重組腺病毒Ad-TSHR289，了解一下！
甲亢是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，是由于甲狀腺合成釋放過多的甲狀腺激素，造成機體代謝亢進和交感神經興奮。甲亢病因很多，與情緒，碘營養，自身免疫，家族遺傳性都有關系，常見的有彌漫性毒性甲狀腺腫（又稱Graves’ disease，GD）、炎性甲亢、藥物致甲亢、HCG相關性甲亢和垂體TSH瘤甲亢，其中以Graves甲亢最為常見，約占所有甲亢的60%~80% 。
Graves甲亢每年發病率約為萬分之四，其發病關鍵是在環境與遺傳因素的相互作用下，機體免疫系統產生了針對促甲狀腺激素受體 (TSHR) 的自身抗體（TSAb），TSAb與TSHR的結合激活下游信號級聯反應，模仿TSH持續刺激的效果，從而導致甲狀腺功能亢進，若不及時治療，會導致高發病率和死亡率。此外，Graves甲亢相關眼病折磨著大約50%的患者，尤其難以治療。
1、促甲狀腺激素受體（TSHR）
TSHR是一種細胞表面糖蛋白受體，屬于G蛋白偶聯受體（GPCR）家族成員，由764個氨基酸組成，分子量為87kDa。人類TSHR編碼基因位于14號染色體長臂(14q31)，基因共含10個外顯子，前九個外顯子編碼胞外龐大的N-端區，該胞外區包含一個富含亮氨酸的重復結構域，通過鉸鏈區與跨膜結構域相連；第十個外顯子則編碼七個跨膜片段以及胞內短小的C-末端。不同于其他糖蛋白激素受體，TSHR胞外結構域中插入了一個包含50個氨基酸的序列（C肽），在翻譯后修飾過程中，金屬蛋白酶介導的分子內裂解作用使TSHR的N-端胞外結構域與跨膜螺旋結構域分離，C肽序列被移除，使TSHR轉化為通過二硫鍵連接的A亞基（289aa）和B亞基。
TSHR基因組結構示意圖
TSHR蛋白結構示意圖
2、TSHR自身抗體（TRAb）
TRAb是一種甲狀腺自身抗體，能特異性地針對甲狀腺細胞膜表面的TSHR。根據生理學作用的不同，可將TRAb分為甲狀腺刺激性抗體（TSAb）及甲狀腺刺激阻斷抗體（TBAb）。TSAb存在于Graves病患者的血清中，與TSHR結合產生類似TSH的生物效應，刺激甲狀腺發生甲亢，是目前GD的首選篩查方法；TBAb存在于自身免疫甲狀腺炎甲減患者，可以與TSHR結合，阻斷TSH的作用，發生甲減。
3、GD的發病機制
TSHR主要在甲狀腺細胞中表達，天然配體是TSH。生理狀態下，TSHR胞外結構域抑制跨膜螺旋結構域的活性，當胞外結構域被TSH特異性結合，其構象改變轉化為跨膜螺旋結構域的激動劑，從而導致TSHR激活，并引起下游細胞內信號級聯反應，以控制甲狀腺生長以及甲狀腺激素的合成與分泌。病理條件下，TSHR結構發生異常改變，在酶解作用下連接A、B兩個亞基的二硫鍵發生溶解斷裂，TSHR-A亞基脫落表達于細胞表面，誘發并增強自身免疫反應，使TSHR作為自身抗原激發機體產生抗體TSAb從而導致甲亢的發生。因此，具有免疫原性的TSHＲ-A亞基是誘發自身免疫反應的關鍵，針對TSHR-A亞基的研究成為GD模型研究的熱點。
4、GD動物造模方法
目前GD發病機制尚不明確，建立符合GD發病特點的動物模型，對疾病的診斷及治療研究都具有重要意義。外源性甲狀腺素補充法和免疫誘導甲狀腺腫是建立誘發性甲亢動物模型的主要方法，其中以表達人TSHR-A亞基的重組腺病毒( Ad-TSHR-289) 免疫誘導的甲亢模型是較為理想且使用廣泛的GD動物模型。
參考案例
The thyrotropin receptor autoantigen in Graves disease is the culprit as well as the victim（The Journal of Clinical Investigation，IF 15.9）
實驗方法
① 腺病毒表達載體的構建及體內注射
研究者分別構建了編碼TSHR游離A亞基（TSHR-289）和TSHR全長（TSHR-D1NET，經歷最小程度的亞基切割）的腺病毒，并以Ad-β-gal及Ad-TSHR-WT作為對照。將上述腺病毒肌肉注射至6-7周齡雌性BALB/c小鼠，病毒用量為1011 particles，注射體積為50μL PBS混懸液。
腺病毒裝載的三種不同結構形式的TSHR
② 腺病毒免疫方法
腺病毒注射小鼠三次，且每次間隔三周，并在第二次注射后1周抽血，在第三次注射后8周（第一次實驗）或4周（第二次實驗）對動物實施安樂死，以獲得血液和甲狀腺。
實驗結果
二次免疫后血清甲狀腺素水平檢測顯示Ad-TSHR-289組有80%的小鼠T4水平增高，而Ad-TSHR-D1NET組僅為10% ; 三次免疫后的檢測得到了類似的結果。組織學檢查顯示90%的Ad-TSHR-289免疫小鼠表現出明顯的甲狀腺腫，而Ad-TSHR-D1NET免疫小鼠僅有20%出現甲狀腺腫。Ad-TSHR-WT免疫的小鼠表現了介于兩者之間的反應。
TSHR腺病毒注射小鼠的甲狀腺腫和組織學比較
cAMP反應測定數據顯示二次免疫后Ad-TSHR-289組小鼠血清中的TSAb活性明顯高于Ad-TSHR-D1NET組，而TBAb活性則顯著低于Ad-TSHR-D1NET組，Ad-TSHR-WT組TSAb和TBAb水平介于二者之間。
表達不同結構形式TSHR的腺病毒免疫的小鼠中的TSAb和TBAb
以上數據說明游離的TSHR-A亞基具有更強的免疫原性，相比TSHR全長能更有效的誘導小鼠GD的發病，具有更高的造模成模率。
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參考文獻：
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3. Chen CR, Pichurin P, Nagayama Y, Latrofa F, Rapoport B, McLachlan SM. The thyrotropin receptor autoantigen in Graves disease is the culprit as well as the victim. J Clin Invest. 2003 Jun;111(12):1897-904.
4. 覃海知，黃一薇，劉強，李承鉉，李海洋，謝春光. 以 Ad-TSHＲ-289 構建 Graves 病動物模型的研究進展. 遼寧中醫雜志2017年第44卷第7期 .
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