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衣殼修飾的工程化AAV

1.研究背景

 基因治療是一種新型的治療手段，它可以治療多種疾病，包括癌癥、遺傳性疾病、神經性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等，它針對的是疾病的根源而不僅僅是疾病的癥狀。如此有效的治療方法有什么特殊性呢？其實很簡單，它就是將外源正常基因借助一定的技術或者載體導入靶細胞，從而糾正或補償缺陷和異常基因引起的疾病，以達到治療疾病的目的（圖1）。

 圖1：基因治療的示意圖（來源于：//www.fda.gov/）

實現基因治療成功的關鍵是載體的選擇。在眾多載體工具中，腺相關病毒載體(Adeno-Associated Viral Vector, AAV Vector)憑借其安全性高、免疫原性低和表達時程長的優勢成為當下基因治療中極具市場前景的病毒載體，從而被越來越多的臨床試驗用于治療各種疾病。截止目前，已有3款基于AAV載體的基因藥物被獲批上市（圖2）：第一款是2012年由歐洲藥品管理局（EMA）批準的GLYBERA® (alipogene tiparvovec, AT)，該藥物由荷蘭UniQure公司研制，用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥（LPLD）；第二款是2017年由美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的LUXTURNA®(voretigene neparvovec-rzyl, VN)，次年又被EMA獲批，該藥物由美國Spark Therapeutics公司研制，用于治療Leber先天性黑蒙癥II型；第3款是2019年同樣由FDA批準的ZOLGENSMA® (onasemnogene abeparvovec-xioi, OA) ，該藥物由美國AveXis公司研制，用于治療2歲以下患兒的脊髓性肌萎縮癥I型。

圖2：3款獲批上市的基于AAV載體的基因藥物的時間表
 (Lugin, M. L., et al. (2020). ACS Nano 14(11): 14262-14283.)

上述取得的成就，再加上美國臨床試驗數據庫（ClinicalTrials.gov）中的一系列臨床前和臨床研究均證實了AAV載體的安全性和有效性。但是野生型AAV畢竟不是為了遞送疾病治療基因而進化的。而且，體內預存的中和抗體和AAV載體的承載能力進一步限制了AAV載體的廣泛應用。目前，科學家們研究的重點主要集中在工程化AAV載體，用于提高其安全性、靶向性和轉導效率。工程化AAV載體的構建方法多種多樣，本篇我們將重點跟大家分享衣殼修飾的工程化AAV載體（圖3）。

 圖3：工程化AAV載體的示意圖

2.AAV基因組結構

了解AAV基因組結構是構建工程化AAV的基礎。野生型AAV含有約4.7kb的單鏈線性DNA基因組，三個基因Rep, Cap和X的兩端各由145bp的ITR組成，可形成T型的發夾結構（圖4）。Rep基因編碼病毒轉錄調控、復制和包裝必需的四個調控蛋白：Rep78, Rep68, Rep52 和Rep40。Cap基因編碼三個重疊的結構蛋白（VP1, VP2, VP3，其表達比例為1:1:10）和VPs入核必需的裝配激活蛋白AAP（assembly-activating protein）。X基因編碼基因組復制中具有支持功能的蛋白質。

圖4：AAV2載體的基因組結構
（Buning, H. and A. Srivastava (2019). Mol Ther Methods Clin Dev 12: 248-265.）

 對于Cap基因，我們從基因組的VPs基因分布上就可以看出，VP3被全部包含在VP2和VP1中，因此，VP3就是3個VPs的共同區域，也被稱為VP3公共區；VP2較VP3長約57個氨基酸的序列，且該序列被包含在VP1中，因此，也叫VP1/VP2公共區；只有VP1 N端獨有大約138個氨基酸的序列，因此，也叫VP1獨特區（VP1u）。VP3公共區負責組裝二十面體衣殼；VP1u含有磷脂酶A2結構域，VP1u和VP1/VP2公共區含有核定位序列NLSs，因此，VP1u和VP1/VP2公共區負責內體運輸&逃離、核定位和基因組釋放。

3.AAV衣殼結構

AAV衣殼結構的解析有助于理解AAV如何感染細胞和確定工程化AAV衣殼修飾的位置。腺相關病毒的衣殼呈T=1二十面體（二十面體是由20個三角形圍成的凸多面體，每5個三角形圍出一個五倍頂，通過每一對相對著的五倍頂有一個五倍旋轉軸；通過每一對相對著的三角形中心有1個三倍旋轉軸；通過每一對相對著的棱的中點有1個二倍旋轉軸）。它由60個VP單體通過這些旋轉軸的相互作用裝配而成，這些VP單體可以全部為VP3，也可以由VP1、VP2、VP3共同構成。
 AAV衣殼表面的顯著特征是二倍凹地，三倍凸起和五倍通道（圖5）。圓柱形通道連通衣殼內外，是AAV DNA進入衣殼的地方，它參與 Rep 蛋白結合、衣殼蛋白裝配、VP1 N 末端外露、AAV病毒感染等多個過程；二倍凹地是病毒衣殼最薄的地方；三倍凸起的主要作用是識別受體。

圖5：由60個VP3裝配成的AAV2衣殼的拓撲結構
 （Tseng, Y. S. and M. Agbandje-McKenna (2014). Front Immunol 5: 9.）

 每個衣殼蛋白的拓撲結構由一個保守的α螺旋（αA）和一個由8股反向平行鏈（βB-βI）構成的β桶核心組成（圖6）。在8股反向平行鏈之間存在4個大的鏈間環（BC，DE，GH，HI，根據環所在位置命名），這些環構成衣殼的外表面。其中，GH環是較大的環，又可以分為多個亞環。這些亞環在主要的衣殼組分VP3中具有較高的序列和結構可變性，經鑒定包含9個可變區（variable regions; VRs），這些VRs在不同的血清間存在差異，主要在受體附著、組織轉導和抗原性方面起作用。

圖6：AAV2 VP3單體的拓撲結構。9個VRs被用不同的顏色標記：
I，紫色；II，藍色；III，黃色；IV，紅色；V，黑色；VI，粉紅色；VII，青色；VIII，綠色；IX，巧克力色
 （Gurda, B. L., et al. (2013). J Virol 87(16): 9111-9124.）

4.衣殼修飾的工程化AAV

特定的VP亞基已被作為衣殼修飾的靶點，例如去除免疫原基序，整合標簽或熒光基團和重新靶向等。
AAV2是研究相對成熟的血清型。以AAV2為骨架，在公共VP3區，大量研究表明，I-587（VP1氨基酸數）和I-588為較常用的衣殼修飾位置，因為這2個位置地處三倍凸起附近，可以接受長達34個氨基酸長度的肽鏈插入，而不影響衣殼化和基因組包裝。而且，外源肽鏈的插入使得AAV2第一受體結合基序被修飾，最終賦予AAV2變體新的靶向性。Buning, H.等人匯總了在I-587和I-588處插入肽鏈的AAV2變體（表1）。維真生物現擁有表1所列的所有AAV Cap質粒，數量近70種，可直接進行AAV病毒包裝。

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表1：在I-587和I-588處插入肽鏈的AAV2變體

Serotype	Position	Name	Target Cell Type	Insert
AAV2	I-587	AAV-I-587	β1-integrin positive tumor cells	QAGTFALRGDNPQG
AAV2	I-587	AAV-588NGR	CD13-positive tumor cells	NGRAHA
AAV2	I-587	AAV-MO7A	tumor cells	RGDAVGV
AAV2	I-587	AAV-MO7T	tumor cells	RGDTPTS
AAV2	I-587	AAV-MecA	tumor cells	GENQARS
AAV2	I-587	AAV-MecB	tumor cells	RSNAVVP
AAV2	I-587	rRGD587	αv integrin positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-587	AAV-C4	tumor cells	PRGTNGP
AAV2	I-587	AAV-D10	tumor cells	SRGATTT
AAV2	I-587	AAV-SIG	endothelial cells	SIGYPLP
AAV2	I-587	AAV-MTP	endothelial cells	MTPFPTSNEANL
AAV2	I-587	AAV-QPE	endothelial cells	QPEHSST
AAV2	I-587	AAV-VNT	endothelial cells	VNTANST
AAV2	I-587	AAV-CNH	endothelial cells	CNHRYMQMC
AAV2	I-587	AAV-CAP	endothelial cells	CAPGPSKSG
AAV2	I-587	AAV-EYH	smooth muscle cells	EYHHYNK
AAV2	I-587	AAV587MTP	skeleton muscle cells	ASSLNIA
AAV2	I-587	AAV-r3.45	neuronal stem cells	TQVGQKT
AAV2	I-587	AAV2-LSS	CNS	LPSSLQK
AAV2	I-587	AAV2-PPS	CNS	DSPAHPS
AAV2	I-587	AAV2-TLH	CNS	GWTLHNK
AAV2	I-587	AAV2-GMN	CNS	GMNAFRA
AAV2	I-587	AAV-Kera1	keratinocytes	RGDTATL
AAV2	I-587	AAV-Kera2	keratinocytes	PRGDLAP
AAV2	I-587	AAV-Kera3	keratinocytes	RGDQQSL
AAV2	I-587	AAV-588Myc	none	EQLSISEEDL
AAV2	I-587	AAV2.N587_R588insBAP	adaptor	GLNDIFEAQKIEWHE
AAV2	I-587	AAV2Ald13	adaptor	LCTPSRAALLTGR
AAV2	I-587	DMD4	vaccine	QVSHWVSGLAEGSFG
AAV2	I-587	DMD6	vaccine	LSHTSGRVEGSVSLL
AAV2	I-588	A588-RGD4C	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-588	A588-RGD4CGLS	av-integrin positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-588	AAV-VTAGRAP	tumor cells	VTAGRAP
AAV2	I-588	AAV-APVTRPA	tumor cells	APVTRPA
AAV2	I-588	AAV-DLSNLTR	tumor cells	DLSNLTR
AAV2	I-588	AAV-NQVGSWS	tumor cells	NQVGSWS
AAV2	I-588	AAV-EARVRPP	tumor cells	EARVRPP
AAV2	I-588	AAV-NSVSLYT	tumor cells (CML)	NSVSLYT
AAV2	I-588	AAV-LS1	tumor cells (CML), CD34+cells	NDVRSAN*
AAV2	I-588	AAV-LS2	tumor cells (CML), CD34+cells	NESRVLS
AAV2	I-588	AAV-LS3	tumor cells (CML), CD34+cells	NRTWEQQ
AAV2	I-588	AAV-LS4	tumor cells (CML), CD34+cells	NSVQSSW
AAV2	I-588	AAV-RGDLGLS	tumor cells	RGDLGLS
AAV2	I-588	AAV-RGDMSRE	tumor cells	RGDMSRE
AAV2	I-588	AAV-ESGLSQS	tumor cells	ESGLSQS
AAV2	I-588	AAV-EYRDSSG	tumor cells	EYRDSSG
AAV2	I-588	AAV-DLGSARA	tumor cells	DLGSARA
AAV2	I-588	AAV-GPQGKNS	tumor cells	GPQGKNS
AAV2	I-588	AAV-NSSRDLG	endothelial cells	NSSRDLG
AAV2	I-588	AAV-NDVRAVS	endothelial cells	NDVRAVS#
AAV2	I-588	AAV-PRSTSDP	lung (maybe endothelial cells)	PRSTSDP
AAV2	I-588	AAV-DIIRA	endothelial cells	DIIRA
AAV2	I-588	AAV-SYENV	endothelial cells	SYENVASRRPEG
AAV2	I-588	AAV-PENSV	endothelial cells	PENSVRRYGLEE
AAV2	I-588	AAV-LSLAS	endothelial cells	LSLASNRPTATS
AAV2	I-588	AAV-NDVWN	endothelial cells	NDVWNRDNSSKRGGTTEAS
AAV2	I-588	AAV-NRTYS	endothelial cells	NRTYSSTSNSTSRSEWDNS
AAV2	I-588	rAAV2-ESGHGYF	pulmonary endothelial cells	ESGHGYF
AAV2	I-588	AAV-GQHPRPG	cardiomyoblasts	GQHPRPG+
AAV2	I-588	AAV-PSVSPRP	cardiomyoblasts	PSVSPRP
AAV2	I-588	AAV2-VNSTRLP	cardiomyoblasts	VNSTRLP
AAV2	I-588	AAV-LSPVR	cardiomyoblasts	LSPVRPG
AAV2	I-588	AAV-MSSDP	cardiomyoblasts	MSSDPRRPPRDG
AAV2	I-588	AAV-GARPS	cardiomyoblasts	GARPSEVTTRPG
AAV2	I-588	AAV-GNEVL	cardiomyoblasts	GNEVLGTKPRAP
AAV2	I-588	AAV-KMRPG	cardiomyoblasts	KMRPGAMGTTGEGTRVTRE
AAV2	I-588	AAV588MTP	skeleton muscle	ASSLNIA

除了I-587和I-588外，I-453、I-520&I-584、I-584、I-585也已被成功用于開發新細胞靶向性工程化AAV（表2）。

表2：非I-587和I-588衣殼變體

Serotype	Position	Name	Target Cell Type	Insert
AAV2	I-453	rRGD453ko	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-453	AAV-MNVRGDL	endothelial cells	MNVRGDL
AAV2	I-453	AAV-ENVRGDL	endothelial cells	ENVRGDL
AAV2	I-520 and I-584	A520/N584 (RGD)	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-584	A584-RGD4C	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-584	A584-RGD4CALS	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-585	AAV-?IV-NGR	CD13-positive tumor cells	NGRAHA
AAV2	I-585	AAV-PTP	Plectin-positive tumor cells	KTLLPTP

 正如研究背景中所述，體內預存中和抗體是限制AAV廣泛臨床應用的一大障礙。血清學研究表明，大多數人都接觸過野生型AAV，因此體內可能已經形成針對AAV的中和抗體。這些中和抗體可能會干擾AAV進入靶細胞、細胞內運輸和細胞核內的解包裝，從而阻止了轉導。據報道，抗AAV抗體在人群中的流行率約為40-80%。其中，抗AAV2的中和抗體在人群中相對更流行。為了克服這個障礙，科學工作者以其他低免疫原性血清型為骨架，并參考AAV2的衣殼修飾位點，開發了一系列新的工程化AAV（表3）。

表3：非AAV2骨架的工程化AAV

Serotype	Position	Name	Target Cell Type	Insert
AAV1	I-590	BAP-AAV1	Scavidin displaying BT4C (rat glioma)	GLNDIFEAQKIEWHE
AAV1	I-590	BAP-AAV1	endothelial cells	GLNDIFEAQKIEWHE plus CDCRGDCFC(RGD4C)
AAV1	I-590	AAV1-RGD	tumor cells, endothelial cells	CDCRGDCFC
AAV1	I-590	AAV1-RGD/BAP (90/10) (mosaic capsid)	tumor cells, endothelial cells	CDCRGDCFC and GLNDIFEAQKIEWHE
AAV1	I-590	Tet1c-AAV1 (mosaic capsid)	tetanus toxin GT1b receptor positive cells	HLNILSTLWKYR
AAV1	I-590a	AAV1.9-3-SKAGRSP	fibroblast	SKAGRSP
AAV5	I-575	BAP-AAV4	tumor cells	GLNDIFEAQKIEWHE
AAV6	I-585	AAV6-RGD	tumor cells	RGD
AAV6	I-585 plus Y705-731F+T492V	AAV6-RGD-Y705-731F+T492V	tumor cells	RGD
AAV6	I-585plus Y705-731F+T492V+K531E	AAV6-RGD-Y705-731F+T492V+K531E	tumor cells	RGD
AAV8	I-585c	AAV2/8-BP2	on-bipolar cells	PERTAMSLP
AAV8	I-590	AAV8-ESGLSOS	tumor cells	ESGLSOS135
AAV8	I-590	AAV8-ASSLNIA	heart (weakly improved transduction)	ASSLNIA122
AAV8	I-590d	AAV8-GQHPRPG	heart (weakly improved transduction)	GQHPRPG86
AAV8	I-590d	AAV8-SEGLKNL	liver	SEGLKNL
AAV9	I-589	AAV-SLRSPPS	endothelial cells, smooth muscle cells	SLRSPPS
AAV9	I-589	AAV-RGDLRVS	endothelial cells, smooth muscle cells	RGDLRVS
AAV9	I-589d	AAV9-NDVRAVS	endothelial cells	NDVRAVS82
AAV9	I-589d	AAV9-ESGLSOS	tumor cells (weak targeting)	ESGLSOS135
AAV9	I-588	AAV-PHP.B	CNS	TLAVPFK
AAV9	I-588	AAV-PHP.A	CNS	YTLSQGW
AAV9	I-588	AAV9-7m8	retinal cells	LGETTRP80
AAV9P1	not disclosed	AAV9P1	neuronal progenitor cells	RGDLGLS

如若了解靶向同一類細胞的所有血清型間的效果差異，請參考Reference 2中對應的參考文獻。

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5.結束語

 目前AAV基因藥物的臨床研究大多數采用的是天然的衣殼，這些衣殼極易成為宿主酶的作用靶點，從而影響它們的整體性能。此外，天然AAV血清型具有組織親噬性，但通常趨向性比較廣泛。因此，必須使用高劑量的病毒才能達到治療效果。而且，AAV載體的包裝容量和大多數人群中已存的中和抗體進一步限制了AAV的臨床應用。為了克服這些限制，科學工作者將研究的重點聚焦在工程化AAV，以進一步提高其安全性、有效性和特異性，從而推動基因治療領域的快速發展。在當今基因治療的研究熱潮下，為了加快您的科研進程，我們建立了工程化AAV庫，旨在為基因治療的發展貢獻自己的一份力。

6.參考文獻

1. Lugin, M. L., et al. (2020). "Synthetically Engineered Adeno-Associated Virus for Efficient, Safe, and Versatile Gene Therapy Applications." ACS Nano 14(11): 14262-14283.
2. Buning, H. and A. Srivastava (2019). "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors." Mol Ther Methods Clin Dev 12: 248-265.
3. Pipe, S., et al. (2019). "Clinical Considerations for Capsid Choice in the Development of Liver-Targeted AAV-Based Gene Transfer." Mol Ther Methods Clin Dev 15: 170-178.
4. Tseng, Y. S. and M. Agbandje-McKenna (2014). "Mapping the AAV Capsid Host Antibody Response toward the Development of Second Generation Gene Delivery Vectors." Front Immunol 5: 9.
 5. Gurda, B. L., et al. (2013). "Capsid antibodies to different adeno-associated virus serotypes bind common regions." J Virol 87(16): 9111-9124.