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腦是人體最(zui)神秘(mi)、最(zui)復雜的器官，由近1011個神經(jing)元組成(cheng)，形(xing)成(cheng)約1014-15個(ge)突觸，這種復雜的(de)神經環路網絡(luo)為認(ren)知、情(qing)感(gan)、記憶(yi)、感(gan)覺和運(yun)動等大(da)(da)腦(nao)高級功能(neng)建(jian)立了穩固的(de)結構(gou)基礎。如(ru)何認(ren)識神經元的(de)連接(jie)方式，描繪神經環路的(de)精(jing)(jing)細結構(gou)并認(ren)知其功能(neng)對于了解大(da)(da)腦(nao)的(de)復雜功能(neng)至關重要。科學(xue)家們(men)一直致力于找到(dao)可以(yi)(yi)特異(yi)性標記細胞(bao)種類、傳導方向可控、可視化的(de)示蹤工具，以(yi)(yi)期(qi)實現(xian)對神經環路網絡(luo)的(de)精(jing)(jing)確(que)認(ren)識和研究(jiu)。
利(li)用神經(jing)示蹤工(gong)具實現對神經(jing)環路的精確(que)標記，主(zhu)要涉及兩大(da)基(ji)本問題即(ji)方向(xiang)性(xing)（順向(xiang)、逆向(xiang)）和是否跨突觸。順向(Anterograde)是由注射部位的(de)神經元胞體經軸突(tu)下(xia)行至末(mo)梢，逆向(Retrograde)是由軸突末梢傳(chuan)到細胞體；順向(xiang)跨突觸是(shi)從胞(bao)體傳到(dao)軸突(tu)末梢后跨過突(tu)觸傳遞(di)至(zhi)下一級神經元，逆向跨突觸(chu)跟順向(xiang)跨(kua)突(tu)(tu)觸相反，是由胞體逆向(xiang)跨(kua)突(tu)(tu)觸傳(chuan)遞至上一級神經元的軸突(tu)(tu)。如下圖所示(shi)：
（Strick P L，et al.，eLS，2011）
小V帶領大(da)家一起了解神(shen)經環路(lu)示蹤(zong)工(gong)具的(de)(de)發展歷程(cheng)，共同感受神(shen)經科學研究領域的(de)(de)飛速進步。
傳統神經(jing)示蹤工具
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種類 |
名稱(cheng) |
特點(dian) |
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辣根過氧化物(wu)酶 |
辣根過氧化物酶(HRP) |
逆行(xing)示蹤劑，染(ran)色局限(xian)于(yu)細胞體(ti)和(he)初生樹突 |
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蛋白 |
霍亂毒素B亞(ya)基(CTb) |
逆行示(shi)蹤劑，無毒 |
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熒光(guang)染料 |
熒光金(Fluoro Gold)
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逆行示(shi)蹤劑，顯示樹突(tu)分支(zhi)，易(yi)觀(guan)察，不易(yi)擴散 |
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羰化青（Dil） |
逆行示蹤劑(ji)，顯示(shi)軸突，熒光強而穩(wen)定，無毒，不易(yi)擴散 |
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生物素 |
生(sheng)物素(su)化葡聚糖(tang)胺(an)（BDA）
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順行示蹤劑，保存(cun)時間(jian)長，可與多種熒光示蹤劑及免疫組化技術相結合 |
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凝集(ji)素 |
麥芽凝集素（WGA）、菜豆凝集素(PHA) |
順行示蹤劑，注射(she)后需要較長的存(cun)留(liu)時間才能實現轉運 |
上述(shu)這些傳統的示(shi)蹤劑被廣泛用于確定實驗(yan)動物不同腦區之(zhi)間神經元的連接，促進(jin)了人們對(dui)大(da)腦神經網絡(luo)結構的認識，但它們仍有以下(xia)缺(que)點：①無法特異(yi)性標記(ji)細胞(bao)類型；②幾(ji)乎沒(mei)有跨突(tu)觸能力；③不能用(yong)于傳(chuan)遞外源基因(yin)；難以用(yong)于多個腦區、多種(zhong)類型(xing)神(shen)經(jing)元通過突觸連接形成的(de)復(fu)雜(za)神(shen)經(jing)網絡研究。
病毒示蹤劑的(de)出現(xian)為上(shang)述問題的(de)解決提供了新方案，并成為追(zhui)蹤神經網絡連接的(de)有效工具。
病毒示蹤工具
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病毒名稱和描(miao)述 |
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順(shun)向跨突觸病毒 |
HSV |
dsDNA，~152kb，包(bao)裝容量~130kb。毒力和傳播方(fang)向(xiang)具(ju)有菌(jun)株(zhu)依賴性。H129株(zhu)優先順向(xiang)跨(kua)突(tu)觸(chu)示蹤 |
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VSV |
-ssRNA，11-12kb，包裝容(rong)量<6kb。對人的(de)(de)毒(du)(du)性較低，極短時(shi)間(jian)高豐(feng)度表達(da)目(mu)的(de)(de)蛋白(bai)，可被其他病毒(du)(du)的(de)(de)囊膜(mo)糖蛋白(bai)包裝而獲(huo)得不同方向的(de)(de)跨突觸能力 |
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逆向跨突觸病毒 |
RV |
-ssRNA，11.9kb，包裝(zhuang)容量<6kb。主要標記神經元，可導致致命的人畜共患疾病。改造的復制缺陷型RV毒性較低 |
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PRV |
dsDNA，~150kb，包裝容量~130kb。不能感染(ran)高等靈長類；野生型PRV毒性極高且雙向傳(chuan)播。改(gai)造的(de)PRV-Bartha株逆行跨(kua)突觸示蹤，毒性較低 |
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AAV血清型種類(lei)多，不同(tong)(tong)的(de)血清型對神經元有(you)不同(tong)(tong)的(de)感(gan)染特性。神經科學研(yan)究中常用的(de)AAV血清型有2、5、8、9、DJ、1/2、PHP、Anc80等，它們有高(gao)效轉導神經元的(de)能力，可根據標記的(de)神經元選(xuan)擇合適的(de)AAV血清型。此外，科學家也一(yi)直(zhi)致力于(yu)AAV新血清型的開發研究，近日國際基因治療領域著名專家高光坪教授及其課題組鑒定出一種新AAV血清型(xing)AAVv66，其與(yu)AAV2具有高(gao)度(du)序列相似性(xing)，但比AAV2產率更(geng)高、病毒(du)穩定性(xing)更(geng)高及更(geng)好的中樞神經系統轉導能力，通過顱內和全身(shen)注射給(gei)藥(yao)時，AAVv66在腦組織內分(fen)布較AAV2更好(hao)。
常見(jian)的AAV病毒載體(ti)都是順向非跨突觸(chu)標記(ji)，AAV的逆向非跨突觸和順向跨突觸標記能力在科學家的潛心研究下取得了滿意成果，并被廣大研究者用于神經環路研究：
rAAV2-retro（逆向非跨突觸標記(ji)）
2016年D. GowanlockR. Tervo等通(tong)過定(ding)向進化(hua)的方法構建了一種新的AAV變體— rAAV2-retro，該變(bian)體(ti)具有逆(ni)行示蹤(zong)能力且(qie)效率(lv)與(yu)傳統的逆(ni)行示蹤(zong)劑相當，由此AAV的逆向非跨突觸標(biao)記能力(li)被成(cheng)功開發。下圖所示為rAAV2-retro的開發(fa)過(guo)程及應用實(shi)例：
AAV1（順向跨突(tu)觸示蹤）
2017年張礪教授團隊研究報道AAV1在高(gao)滴度條件下呈順向跨突(tu)觸傳播(bo)，與Cre依賴的報告系統相結合(he)，可高效和特(te)異性地驅動Cre依賴(lai)的外源基(ji)因在突(tu)觸后神經元中表達，標記突(tu)觸后神經元。2020年該研(yan)(yan)究團隊再次深入研(yan)(yan)究了AAV1順向跨突(tu)觸標記的(de)(de)作用(yong)機制——依賴于突(tu)觸囊泡的(de)(de)釋放，同時揭示了其在多(duo)種神(shen)經環(huan)路中的(de)(de)廣泛應用(yong)，為AAV作為順向(xiang)跨突觸示蹤病毒工具對神(shen)經元及(ji)其投(tou)射(she)腦區進行標記提供了諸多證據。我們相信AAV在(zai)神經環路中的應用將會越來越廣泛。（研究(jiu)所(suo)用的AAV病毒(du)部分由維真生(sheng)物提供，欲知詳情請點擊往期(qi)回顧：）
AAV轉導神經元需要(yao)宿主細(xi)胞(bao)合成其(qi)基因的(de)互(hu)補鏈，因此(ci)基因的(de)高表(biao)達需要(yao)較(jiao)多病毒顆粒和較(jiao)長時(shi)間才能實現。雙(shuang)鏈(lian)AAV(self-complementary AAV，scAAV) 進入(ru)細(xi)胞后，不需要(yao)由單鏈(lian)變為雙(shuang)鏈(lian)的過程，基(ji)因表(biao)達(da)更為快速，表(biao)達(da)水平更高，不過scAAV的裝載量只有(you)單(dan)鏈AAV的一(yi)半。例如2020年張礪教授(shou)團隊的科研論文就(jiu)使用了scAAV，證實了scAAV1-hSyn-Cre具有更(geng)優(you)越(yue)的(de)順向跨突觸標記能(neng)力(li)，可在興奮(fen)性(xing)、抑制(zhi)性(xing)、神經調質和腦(nao)-脊(ji)髓等(deng)多種(zhong)神經環路中有效、特異地標記單突觸靶神經元及其輸(shu)出，從而解析不(bu)同的(de)功能(neng)/行(xing)為。
總 結
維真生物神經示蹤工具AAV產品及服務
如有需(xu)要，歡迎致電400-077-2566！
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產(chan)品編號 |
產品名稱 |
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AV204006-AVretro |
AAVretro-hSyn-Cre |
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AV204006-AV1 |
AAV1-hSyn-Cre |
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AV204046-AV1 |
scAAV1-hSyn-Cre |
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AV204006-AV2retro |
AAV2 retro-hSyn-Cre |
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AV204049-AV1 |
AAV1-hSyn-Flp |
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AV204050-AV1 |
AAV1-CAG-DIO-Flp |
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AV204054-AV1 |
AAV1-EF1a-DIO-Flp |
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…… |
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熒光蛋白（標記神經元） |
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AV200001-AV2retro |
AAV2 retro-CMV-GFP |
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AV200007-AV2retro |
AAV2 retro-hSyn-GFP |
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AV200109-AV1 (Cre依賴) |
AAV1-CAG-DIO-GFP |
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AV200160-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-CAG-DIO-mCherry |
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AV200145-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-mCherry |
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AV200096-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-hSyn-DIO-GFP |
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AV200096-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-hSyn-DIO-GFP |
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AV200146-AV9 (Cre依(yi)賴(lai)) |
AAV9-hSyn-DIO-mCherry |
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AV200117-AV9 (Cre依賴(lai)) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-GFP |
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AV200147-AV5 (Cre依賴) |
AAV5-CaMKIIa-DIO-mCherry |
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AV200147-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-mCherry |
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…… |
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光遺傳學(操控神經元) |
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AV201006-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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AV201006-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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AV201007-AV2 (Cre依(yi)賴) |
AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
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AV201007-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
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AV201017-AV9 (Cre依(yi)賴) |
AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP |
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AV201021-AV9 (Cre依(yi)賴) |
AAV9-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP |
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AV201003-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-CaMKIIa-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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…… |
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化學遺傳學(操(cao)控神經元) |
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AV202014-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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AV202010-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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AV202015-AV9 (Cre依賴(lai)) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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…… |
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鈣指示劑(神經(jing)元成像) |
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AV203009-AV2retro (Cre依(yi)賴(lai)) |
AAV2-retro-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203006-AV8 (Cre依賴) |
AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203006-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV8 (Cre依賴(lai)) |
AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV DJ (Cre依賴(lai)) |
AAV-DJ-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203016-AV9 (Cre依(yi)賴(lai)) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato |
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AV203004-AV5 (Cre依賴) |
AAV5-hSyn-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203046 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7b-P2A-nls-dTomato |
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AV203047 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7c-P2A-nls-dTomato |
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AV203048 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7s-P2A-nls-dTomato |
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AV203049-AV9 (Cre依(yi)賴(lai)) |
AAV9-EF1a-DIO-jGCaMP7f-P2A-nls-dTomato |
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…… |
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另有AAV9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB等可跨血腦屏障的血清型AAV產品。關注我們了解更多產品詳情~
Reference
1. Saleeba, C., et al., A Student's Guide to Neural Circuit Tracing. Front Neurosci, 2019. 13: p. 897.
2. Sun L, Tang Y, Yan K, et al. Differences in neurotropism and neurotoxicity among retrograde viral tracers. Mol Neurodegener. 2019;14(1):8. Published 2019 Feb 8. doi:10.1186/s13024-019-0308-6.
3. Li J, Liu T, Dong Y, Kondoh K, Lu Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neurosci Bull. 2019;35(5):909-920. doi:10.1007/s12264-019-00374-9.
4. Zingg, B., et al., AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron, 2017. 93(1): p. 33-47.
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7.Hsu, H., Brown, A., Loveland, A.B. et al. Structural characterization of a novel human adeno-associated virus capsid with neurotropic properties. Nat Commun 11, 3279 (2020).
