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大腦是(shi)人(ren)體中(zhong)(zhong)樞神經系統(tong)中(zhong)(zhong)最(zui)高級(ji)的(de)(de)部(bu)分(fen)，是(shi)思維的(de)(de)器(qi)官，是(shi)心智(zhi)和意識(shi)的(de)(de)物質本體，也(ye)是(shi)結構(gou)最(zui)復雜、功能最(zui)完善的(de)(de)器(qi)官，其對生命之重毋庸置(zhi)言。雖然近(jin)幾十年(nian)神經科學得到了快速(su)的(de)(de)發展，然而，時至今(jin)日大腦仍屬(shu)于人(ren)類知之甚少(shao)的(de)(de)人(ren)體構(gou)造之一。
腦(nao)(nao)行使功能(neng)的(de)(de)(de)(de)結(jie)構基(ji)(ji)礎(chu)是(shi)神經(jing)環路，那么如(ru)何解(jie)析(xi)大腦(nao)(nao)不同腦(nao)(nao)區、不同類(lei)型神經(jing)元(yuan)之(zhi)間(jian)神經(jing)環路的(de)(de)(de)(de)結(jie)構和(he)功能(neng)呢？神經(jing)示(shi)蹤(zong)技術是(shi)帶(dai)領我(wo)們(men)探(tan)索大腦(nao)(nao)功能(neng)的(de)(de)(de)(de)工具之(zhi)一。傳統的(de)(de)(de)(de)神經(jing)示(shi)蹤(zong)技術存在諸多缺點，如(ru)無法實(shi)現(xian)細(xi)胞特異(yi)性標(biao)記、無法攜(xie)帶(dai)基(ji)(ji)因、信號(hao)衰減等(deng)。作(zuo)為新興(xing)神經(jing)示(shi)蹤(zong)工具的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)載(zai)體為這些問題的(de)(de)(de)(de)解(jie)決提供了(le)新方案(an)，是(shi)目(mu)前最為有效(xiao)、應用(yong)(yong)最廣的(de)(de)(de)(de)示(shi)蹤(zong)工具。基(ji)(ji)于噬(shi)(shi)神經(jing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)發展(zhan)來的(de)(de)(de)(de)狂犬病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(RV)和(he)偽(wei)狂犬病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(PRV)是(shi)成熟的(de)(de)(de)(de)、廣泛使用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)跨(kua)突(tu)(tu)(tu)觸(chu)(chu)逆向病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)示(shi)蹤(zong)劑；而基(ji)(ji)于噬(shi)(shi)神經(jing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)發展(zhan)來的(de)(de)(de)(de)單純皰(pao)疹病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(HSV)和(he)水皰(pao)性口炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(VSV)可以實(shi)現(xian)跨(kua)突(tu)(tu)(tu)觸(chu)(chu)順(shun)向標(biao)記，但是(shi)其(qi)神經(jing)毒(du)(du)性和(he)跨(kua)突(tu)(tu)(tu)觸(chu)(chu)不可控，限(xian)制了(le)其(qi)在解(jie)析(xi)神經(jing)環路研(yan)究中的(de)(de)(de)(de)應用(yong)(yong)，因此，這迫切需要我(wo)們(men)尋找(zhao)一種(zhong)優良的(de)(de)(de)(de)跨(kua)突(tu)(tu)(tu)觸(chu)(chu)順(shun)向病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)示(shi)蹤(zong)劑。
除噬神經病毒外，AAV近年也被用于環路示蹤，因為AAV具有復制缺陷性和極低的免疫原性，不會造成大量的神經毒性。大部分的研究使用AAV進行非跨突觸標記。2014 Castle等人發現AAV1可順向示蹤神經元，但是其潛在跨突觸的證據還不清楚并存在爭議。直到2017年，南加利福尼亞大學的 張礪教授帶領的團隊在《Neuron》發表的“AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors”，首次證實了AAV可順向跨單級突觸傳導，研究表明高(gao)滴度的(de)AAV2/1-hSyn-Cre能(neng)(neng)有效(xiao)、特(te)異跨單級突觸(chu)標記神經元及其輸(shu)出，這為利用順向跨突觸(chu)病毒(du)工具研究大(da)腦復雜功能(neng)(neng)提供了可(ke)能(neng)(neng)性。
今天小V和大家分享AAV順向跨突觸傳導的最新研究成果。
2020年4月，張礪教授帶領的團隊又在《The Journal of Neuroscience》發表題為“Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry”的(de)(de)論文，深入研究了AAV病毒順向跨突觸(chu)傳(chuan)導的(de)(de)突觸(chu)特異性和在(zai)多種神經環路中的(de)(de)廣(guang)泛(fan)應用。
解剖結構(gou)的(de)(de)(de)研究結果(guo)如下(xia)圖：在Ai14 x GAD67-GFP 小(xiao)鼠的(de)(de)(de)腦(nao)橋核PN和下(xia)橄欖核IO分別注射(she)scAAV1-hSyn-Cre，發現小(xiao)鼠的(de)(de)(de)來自PN的(de)(de)(de)投射(she)標記出小(xiao)腦(nao)大量(liang)的(de)(de)(de)顆粒細(xi)胞GCs，而(er)小(xiao)鼠的(de)(de)(de)來自IO的(de)(de)(de)投射(she)標記出小(xiao)腦(nao)中的(de)(de)(de)浦肯野(ye)細(xi)胞PCs，從而(er)證實了AAV順向跨突觸傳(chuan)導可特異性標記突觸后(hou)的(de)(de)(de)細(xi)胞群(qun)。
進一步研(yan)究(jiu)了AAV順(shun)向(xiang)跨(kua)突觸(chu)傳(chuan)導(dao)的(de)突觸(chu)特(te)異性的(de)功能(neng)特(te)征(見下圖)。將scAAV1-hSyn-Cre和AAV1-EF1a-DIO-ChR2-YFP 1:1混(hun)合注射(she)入Ai14 小鼠初級視覺皮層V1，只有(you)共轉這2種病毒的(de)神(shen)經(jing)元(yuan)才能(neng)表達ChR2，采用全細(xi)胞記錄技術，藍(lan)光誘發突觸(chu)前神(shen)經(jing)元(yuan)興(xing)奮，產生動(dong)作電位，動(dong)作電位傳(chuan)導(dao)到(dao)突觸(chu)后神(shen)經(jing)元(yuan)也可以產生神(shen)經(jing)沖動(dong)，發現其功能(neng)性連接的(de)下丘(qiu)神(shen)經(jing)元(yuan)IC被標記，且在TTX和4-AP存(cun)在的(de)時候沒有(you)變化。證明(ming)AAV1更傾向(xiang)于標記注射(she)點下游(you)突觸(chu)連接的(de)神(shen)經(jing)元(yuan)。
作(zuo)者探(tan)究了(le)AAV1從(cong)突觸(chu)末端(duan)釋放的(de)(de)機理（見下圖）。將AAVDJ-CMV-TeNT-P2A-GFP ( AAV1-hSyn-GFP 作(zuo)為對(dui)照) 注(zhu)射入Ai14小鼠的(de)(de)初級視覺皮層(ceng)V1。14天后在同一腦區注(zhu)射入scAAV1-hSyn-Cre，并(bing)在2周后檢測上丘(qiu)SC中 tdTomato+細胞數(shu)目。結(jie)果顯示：TeNT組(zu)跨突觸(chu)標記tdTomato +細胞數(shu)目較(jiao)對(dui)照組(zu)減少約94%。TeNT可通過切(qie)割VAMP2從(cong)而(er)完全(quan)阻(zu)斷Ca2+誘發的(de)(de)突觸(chu)囊泡(pao)(pao)融合和(he)神(shen)經(jing)遞質的(de)(de)釋放，從(cong)而(er)證實了(le)AAV的(de)(de)傳導明顯依(yi)賴(lai)于突觸(chu)囊泡(pao)(pao)的(de)(de)釋放。
抑制(zhi)(zhi)性(xing)神經(jing)環路中(zhong)的(de)(de)研究結果見下(xia)圖(tu)。將scAAV1 - hSyn - Cre注射到(dao)紋狀體Str中(zhong)，Str中(zhong)含有GABA能棘狀神經(jing)元，它可(ke)(ke)以投(tou)射到(dao)黑質網狀核(he)SNr中(zhong)的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)性(xing)細胞(bao)。14天后，發現SNr中(zhong)的(de)(de)神經(jing)元被(bei)標(biao)記(ji)；此外，作者(zhe)還(huan)測(ce)試了AAV1從SNr中(zhong)的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)性(xing)神經(jing)元擴散到(dao)丘腦腹內側核(he)VM中(zhong)的(de)(de)興奮(fen)性(xing)神經(jing)元的(de)(de)概(gai)率，發現VM中(zhong)也有相當(dang)數量(liang)的(de)(de)神經(jing)元被(bei)標(biao)記(ji)，證明AAV1可(ke)(ke)以用于抑制(zhi)(zhi)性(xing)神經(jing)元投(tou)射順(shun)向跨突觸標(biao)記(ji)不同類型的(de)(de)多(duo)種(zhong)細胞(bao)。
神(shen)經(jing)(jing)調(diao)(diao)質神(shen)經(jing)(jing)環路(lu)中(zhong)的研(yan)究結果見下圖。將(jiang)scAAV1-hSyn-Cre注射入(ru)Ai14 小鼠斜帶核NDB、背側中(zhong)縫核DR和(he)藍斑LC中(zhong)，14天后，發現其(qi)(qi)投射的下游腦區神(shen)經(jing)(jing)元(yuan)被稀(xi)疏(shu)或者零標記。證(zheng)明AAV1順(shun)向跨(kua)突觸標記能力在神(shen)經(jing)(jing)調(diao)(diao)質能的神(shen)經(jing)(jing)環路(lu)中(zhong)的應用(yong)比較局限：在谷氨酸(suan)和(he)γ氨基丁(ding)酸(suan)神(shen)經(jing)(jing)環路(lu)中(zhong)，AAV1具有高效的順(shun)向跨(kua)突觸標記能力；而乙酰膽堿、五羥色胺和(he)去甲腎上腺素神(shen)經(jing)(jing)環路(lu)中(zhong)則(ze)顯得(de)極其(qi)(qi)遜色。
腦-脊髓(sui)(sui)投射(she)神經環路(lu)中的(de)研究結果(guo)見下(xia)圖。將scAAV1-hSyn-Cre注射(she)入Ai14 小鼠的(de)初級(ji)運動(dong)皮層Mop-II、初級(ji)軀(qu)體感覺皮層SSP-II、外側下(xia)丘(qiu)腦LHA、紅核RN中，14天后，發現脊髓(sui)(sui)頸椎、胸椎和(he)腰椎處神經元被不同程度標(biao)記(ji)，證(zheng)明AAV1在(zai)腦-脊髓(sui)(sui)投射(she)神經環路(lu)中具(ju)有順向跨突(tu)觸(chu)標(biao)記(ji)能(neng)力，為進一步研究腦-脊髓(sui)(sui)投射(she)神經環路(lu)功能(neng)奠定了基礎(chu)。
通過比較不(bu)同AAV血清(qing)型和(he)嗜神經病毒(du)，發現AAV1具(ju)有順(shun)向跨(kua)突(tu)觸(chu)標(biao)(biao)記(ji)(ji)能(neng)(neng)力(li)(li)，然(ran)而AAV1的(de)(de)(de)順(shun)向跨(kua)突(tu)觸(chu)標(biao)(biao)記(ji)(ji)能(neng)(neng)力(li)(li)非(fei)常(chang)弱，需要聯(lian)合重組酶系統(如Cre or Flp)進行放(fang)(fang)大(da)，從(cong)而啟動(dong)轉基因(yin)的(de)(de)(de)強(qiang)表達。相比AAV1-hSyn-Cre，scAAV1-hSyn-Cre表現出了更優越的(de)(de)(de)順(shun)向跨(kua)突(tu)觸(chu)標(biao)(biao)記(ji)(ji)能(neng)(neng)力(li)(li)：本研(yan)(yan)究(jiu)從(cong)解剖、功能(neng)(neng)和(he)分子(zi)層(ceng)面深(shen)入(ru)研(yan)(yan)究(jiu)了AAV1順(shun)向跨(kua)突(tu)觸(chu)傳導的(de)(de)(de)突(tu)觸(chu)特異性，并(bing)闡(chan)述(shu)了其(qi)作用(yong)機(ji)制整體上依(yi)賴(lai)于(yu)(yu)突(tu)觸(chu)囊泡的(de)(de)(de)釋放(fang)(fang)；scAAV1-hSyn-Cre可在興奮性、抑制性、神經調質和(he)腦-脊(ji)髓(sui)等多種神經環(huan)路中有效、特異地標(biao)(biao)記(ji)(ji)單(dan)突(tu)觸(chu)靶神經元及其(qi)輸出，從(cong)而解析不(bu)同的(de)(de)(de)功能(neng)(neng)/行為。總之，scAAV1-hSyn-Cre具(ju)有有效、特異跨(kua)突(tu)觸(chu)標(biao)(biao)記(ji)(ji)能(neng)(neng)力(li)(li)，鑒(jian)于(yu)(yu)其(qi)同時具(ju)有低概(gai)率的(de)(de)(de)逆向示蹤能(neng)(neng)力(li)(li)，它僅適用(yong)于(yu)(yu)精確標(biao)(biao)記(ji)(ji)單(dan)向神經環(huan)路，通過與其(qi)它技術(如轉基因(yin)動(dong)物和(he)稀疏(shu)標(biao)(biao)記(ji)(ji)等)的(de)(de)(de)聯(lian)合運用(yong)可以滿足神經研(yan)(yan)究(jiu)人員(yuan)的(de)(de)(de)多種實驗需求。
本文獻中的部分AAV病毒由維真生物提供，如下表所示：
| 病毒名稱 |
|---|
| scAAV1 hSyn-Cre |
| AAV1 hSyn-Flp |
| AAVretro-hSyn-Cre |
| AAV1-EF1a-DIO-Flp-WPRE |
| AAVretro-hSyn-GFP-WPRE |
下表所示為維真生物多種AAV產品，如有需要，歡迎致電400-077-2566！
| 產品編號 | 產品名稱 |
|---|---|
| Cre/Flp | |
| AV204006-AV1 | AAV1-hSyn-Cre |
| AV204046-AV1 | scAAV1-hSyn-Cre |
| AV204006-AV2 retro | AAV2 retro-hSyn-Cre |
| AV204049-AV1 | AAV1-hSyn-Flp |
| AV204050-AV1 | AAV1-CAG-DIO-Flp |
| AV204054-AV1 | AAV1-EF1a-DIO-Flp |
| …… | |
| 產品編號 | 產品名稱 |
|---|---|
| 熒光蛋白（標記神經元） | |
| AV200001-AV2 retro | AAV2 retro-CMV-GFP |
| AV200007-AV2 retro | AAV2 retro-hSyn-GFP |
| AV200109-AV1 (Cre依賴) | AAV1-CAG-DIO-GFP |
| AV200160-AV2 (Cre依賴) | AAV2-CAG-DIO-mCherry |
| AV200145-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-mCherry |
| AV200096-AV2 (Cre依賴) | AAV2-hSyn-DIO-GFP |
| AV200096-AV9 (Cre依賴) | AAV9-hSyn-DIO-GFP |
| AV200146-AV9 (Cre依賴) | AAV9-hSyn-DIO-mCherry |
| AV200117-AV9 (Cre依賴) | AAV9-CaMKIIa-DIO-GFP |
| AV200147-AV5 (Cre依賴) | AAV5-CaMKIIa-DIO-mCherry |
| AV200147-AV9 (Cre依賴) | AAV9-CaMKIIa-DIO-mCherry |
| …… | |
| 光遺傳學(操控神經元) | |
| AV201006-AV2 (Cre依賴) | AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
| AV201006-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
| AV201007-AV2 (Cre依賴) | AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
| AV201007-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
| AV201017-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP |
| AV201021-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP |
| AV201003-AV2 (Cre依賴) | AAV2-CaMKIIa-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
| …… | |
| 化學遺傳學(操控神經元) | |
| AV202014-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
| AV202010-AV9 (Cre依賴) | AAV9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
| AV202015-AV9 (Cre依賴) | AAV9-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
| …… | |
| 鈣指示劑(神經元成像) | |
| AV203006-AV8 (Cre依賴) | AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
| AV203006-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV8 (Cre依賴) | AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV2 retro (Cre依賴) | AAV2-retro-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV DJ (Cre依賴) | AAV-DJ-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203016-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato |
| AV203004-AV5 (Cre依賴) | AAV5-hSyn-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
| AV203046 | AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7b-P2A-nls-dTomato |
| AV203047 | AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7c-P2A-nls-dTomato |
| AV203048 | AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7s-P2A-nls-dTomato |
| AV203049-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-jGCaMP7f-P2A-nls-dTomato |
| …… | |
1. Castle MJ, Gershenson ZT, Giles AR, Holzbaur ELF, Wolfe JH (2014a) Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Hum Gene Ther 25:705-720.
2. Zingg B, Chou X, Zhang Z, Mesik L, Liang F, Tao HW, Zhang LI (2017) AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocol-licular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron 93:33-47.
3. Brian Zingg, Bo Peng, Junxiang Huang, Huizhong W. Tao, and Li I. Zhang(2020) Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry. The Journal of Neuroscience 40 (16): 3250-3267.
