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【客戶文章】中國科學院昆明動物研究所李家立團隊揭示CircRNA在腦衰老中的生物學作用

人體器官的(de)(de)(de)(de)功能(neng)(neng)會隨著年(nian)齡(ling)的(de)(de)(de)(de)增長(chang)而逐(zhu)漸衰退，腦(nao)也不例外(wai)。腦(nao)衰老會產(chan)生(sheng)涉及分子、細(xi)胞和功能(neng)(neng)水平的(de)(de)(de)(de)特征性神經生(sheng)理(li)變化，了解(jie)這(zhe)些變化及其(qi)分子機制(zhi)對(dui)于研究腦(nao)衰老及其(qi)相關(guan)性疾病具有重要的(de)(de)(de)(de)意(yi)義(yi)。腦(nao)衰老的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物學機理(li)十(shi)分復雜，與遺(yi)傳(chuan)、年(nian)齡(ling)和環(huan)境等多個因素有關(guan)，其(qi)中隨年(nian)齡(ling)和環(huan)境等因素而變化的(de)(de)(de)(de)表觀遺(yi)傳(chuan)調控被認為是重要的(de)(de)(de)(de)調節因素之一(yi)。

已有研(yan)究(jiu)報道哺乳動物腦中(zhong)存在大量的環(huan)狀(zhuang)RNA（CircRNA）。同時，最近(jin)的研(yan)究(jiu)也表明，circRNAs可能作為(wei)(wei)一種新的調控網(wang)絡參與大腦的發(fa)育、成(cheng)熟(shu)和衰老(lao)。但是(shi)，大腦中(zhong)大多數circRNAs的表達模式和功(gong)能尚不(bu)清楚，尤其是(shi)靈長(chang)類動物腦中(zhong)。非人靈長(chang)類動物由于其在遺傳和生理特征(zheng)上(shang)與人類具有相似性，因此，已成(cheng)為(wei)(wei)人類疾(ji)病建模和治療(liao)策略(lve)研(yan)究(jiu)的最有價值的模型之一。

2018年，為了研究circRNA在哺乳動物，尤其是靈長類動物大腦中的表達特點和調控作用，中國科學院昆明動物研究所李家立團隊以獼猴的腦組織為實驗材料進行了系統的circRNA表達特點及功能的研究，相關研究成果發表在《Cell Discovery》，題為“Annotation and functional clustering of circRNA expression in rhesus macaque brain during aging”，文(wen)章揭(jie)示了(le)circRNA的表達在獼猴(hou)大腦(nao)中呈現(xian)組織特(te)異性(xing)、性(xing)別特(te)異性(xing)和年齡(ling)特(te)異性(xing)，并且circRNA與其宿主mRNA之間存(cun)在正相關或(huo)負相關調控關系。

2020年7月，中國科學院昆明動物研究所李家立團隊又在《Nature Communications》（IF=12.121）上發表了題為“CircGRIA1 shows an age-related increase in male macaque brain and regulates synaptic plasticity and synaptogenesis”的研究論文，文章在上述研究工作基礎上發現CircGRIA1的表達在獼猴前額葉皮層和海馬區具有年齡特異性和雄性特異性，并且順式作用于Gria1基因啟動子進而調控Gria1基因的表達；體內外操縱circGRIA1表達能夠負調節Gria1基因的表達，敲低circGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經元的突觸可塑性及突觸再生。該論文強調了(le)CircRNA調控的(de)重要(yao)性，加深了(le)人類對腦衰(shuai)老生物學的(de)了(le)解。

01 CircGRIA1的表達在獼猴大腦中具有年齡差異性和性別差異性

 CircGRIA1是由(you)谷氨酸受體AMPA亞(ya)基(ji)Gria1基(ji)因外顯子4，5，6形成的(de)進(jin)化保(bao)守性circRNA。作者通過(guo)qPCR及Northern blot發(fa)現CircGRIA1在雄性獼猴腦中呈現增齡性表(biao)達升高(gao)，且(qie)與宿主(zhu)（Gria1）mRNA表(biao)達呈負相關。（圖1）

圖1. CircGRIA1和Gria1 mRNA表達的特征

02 CircGRIA1與Gria1 mRNA表達呈負相關

為(wei)了進(jin)一(yi)(yi)步(bu)驗(yan)證CircGRIA1與其(qi)宿主(zhu)(Gria1)mRNA之(zhi)間的(de)負調(diao)控關系，作者又(you)用BASEscope ISH和RNAscope ISH技(ji)術(shu)進(jin)行了進(jin)一(yi)(yi)步(bu)驗(yan)證，發現(xian)雄性獼猴(hou)CircGRIA1的(de)表(biao)達在前額葉皮(pi)層(ceng)（PFC）和海馬的(de)CA1& DG區呈現(xian)隨年齡增長而上升的(de)趨(qu)勢(shi)；而其(qi)宿主(zhu)(Gria1)mRNA的(de)表(biao)達水平則相(xiang)反。（圖(tu)2）

圖2. CircGRIA1與Gria1 mRNA表達呈負相關

03 CircGRIA1與其親本基因Gria1啟動子區的關聯

為了探討CircGRIA1與其宿(su)主(Gria1)mRNA表達(da)負相關的分子機制，作者從體內外用ChIRP技(ji)術研究了與CircGRIA1反向剪接點共(gong)沉淀(dian)的片段，發現(xian)CircGRIA1結合其宿(su)主(Gria1)mRNA的5’UTR，進而發揮負調控功(gong)能(neng)。（圖3）

圖3. CircGRIA1對親本基因組位點的調控作用

04 CircGRIA1負向調控Gria1 mRNA表達

作者(zhe)使用慢病毒載體(MOI=5-10)感染(ran)DIV5的(de)胎猴海馬(ma)神(shen)經元，體外操縱CircGRIA1，通(tong)過BASEscope ISH和RNAscope ISH技(ji)術檢測CircGRIA1和其宿(su)主(Gria1)mRNA的(de)表(biao)達，發(fa)現DIV28，siRNA感染(ran)組的(de)CircGRIA1表(biao)達顯著降低；而其宿(su)主(Gria1)mRNA的(de)表(biao)達水平則升高(gao)。（圖4）

圖4. CircGRIA1負向調控Gria1 mRNA表達

05 CircGRIA1參與突觸形成

接下來，作者探討了CircGRIA1和Gria1表達負相關的生理功能，如是否參與了老化過程中突觸形成前后的調控。首先，作者將AAV9-siRNAs(CircGRIA1)&AAV9-siRNAs(control)病(bing)毒顆(ke)粒微(wei)注射至(zhi)10年齡和(he)20年齡雄性和(he)雌性獼(mi)猴的海(hai)馬區(qu)，6周后，采用(yong)BASEscope ISH、RNAscope ISH和(he)RT-qPCR檢測CircGRIA1和(he)Gria1的表(biao)達(da)水平，發現20年齡雄性獼(mi)猴海(hai)馬中(zhong)CircGRIA1表(biao)達(da)顯著降低，而Gria1 mRNA表(biao)達(da)升(sheng)高。（圖5）

圖5. 敲低CircGRIA1會增加Gria1的表達

接著，作者從體內外檢測了獼(mi)猴(hou)腦(nao)中幾(ji)(ji)個突(tu)觸(chu)組分表(biao)達的年齡相關性(xing)(xing)(xing)變化。免疫(yi)組織化學(xue)結(jie)(jie)(jie)果(見圖6)顯(xian)示，與10年齡雄(xiong)性(xing)(xing)(xing)和雌性(xing)(xing)(xing)獼(mi)猴(hou)相比，20年齡雄(xiong)性(xing)(xing)(xing)和雌性(xing)(xing)(xing)獼(mi)猴(hou)PFC和海馬CA1 & DG區的synapsin-I(突(tu)觸(chu)前囊泡蛋白)和PSD95（突(tu)觸(chu)后膜(mo)骨架蛋白）表(biao)達水平均顯(xian)著降低；敲低CircGRIA1顯(xian)著增加了20年齡雄(xiong)性(xing)(xing)(xing)獼(mi)猴(hou)海馬中synapsin-I的表(biao)達水平，而(er)PSD95表(biao)達水平幾(ji)(ji)乎沒(mei)有變化。CircGRIA1敲低組的體外結(jie)(jie)(jie)果跟體內結(jie)(jie)(jie)果一致。

圖6. 敲低CircGRIA1可增加突觸發生

06 CircGRIA1調控突觸可塑性

突觸可塑(su)性(xing)與(yu)谷氨(an)酸受體(ti)(ti)AMPA和NMDA 介導的(de)神(shen)(shen)經活(huo)動相關。微型(xing)自發的(de)興奮性(xing)突觸后電流(mEPSCs)用(yong)于(yu)模(mo)擬該神(shen)(shen)經活(huo)動。作(zuo)者探究(jiu)了CircGRIA1是否參(can)與(yu)突觸可塑(su)性(xing)。作(zuo)者使用(yong)慢病毒載體(ti)(ti)(MOI=5-10)感染DIV5的(de)胎猴海馬神(shen)(shen)經元，體(ti)(ti)外(wai)操縱(zong)CircGRIA1，跟蹤記錄不同時(shi)間點的(de)mEPSCs。結果顯示DIV28，control組mEPSCs的(de)振幅和頻率均(jun)下降，siRNA感染組則緩(huan)解了這(zhe)種下降。

圖7. CircGRIA1調控突觸可塑性

小 結

維真生物助力產品及病毒用法

本(ben)研究(jiu)工作表明CircGRIA1的表達在老(lao)年雄性(xing)獼猴(hou)腦中表達升高(gao)。它主要定位于細胞核，其與Gria1基因(yin)啟動子(zi)(zi)區域相結(jie)合，以順式作用方式負(fu)調控(kong)Gria1的mRNA和(he)蛋(dan)白水平。體內(nei)外敲減CircGRIA1可(ke)顯著改善老(lao)年雄性(xing)獼猴(hou)海馬神(shen)經元的突觸(chu)可(ke)塑性(xing)及突觸(chu)再生。這些研究(jiu)為(wei)進一(yi)步認(ren)識和(he)理(li)解靈長類動物復(fu)雜(za)的大腦結(jie)構和(he)功能，尋(xun)找參(can)與腦衰老(lao)進程的調控(kong)因(yin)子(zi)(zi)提供了新證(zheng)據，為(wei)探索(suo)衰老(lao)相關神(shen)經疾病的機理(li)和(he)干預措(cuo)施提供了參(can)考。

圖8. 病毒注射部位示意圖

維真生物circRNA相關載體

維真(zhen)生物(wu)科研團隊(dui)已(yi)成功構建(jian)了大量(liang)circRNA表(biao)達載(zai)體(ti)，并建(jian)立了腺(xian)病毒、慢病毒和AAV全套circRNA過表(biao)達和干擾載(zai)體(ti)系統。