AAV在腦組織中的靶向策略（干貨篇）
神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)分為中(zhong)樞神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)（Central nervous system, CNS）和外(wai)周神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)（Peripheral nervous system，PNS）。中(zhong)樞神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)包(bao)括腦和脊髓，分別位于顱(lu)腔(qiang)和椎管內，是神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)的(de)主(zhu)要部分，外(wai)周神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)包(bao)括與腦相連(lian)的(de)腦神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)（cranial?nerves）和與脊髓相連(lian)的(de)脊神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)（spinal?nerves）。隨(sui)著研究的(de)深入，人們對神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)功能(neng)已經(jing)(jing)有(you)了更近(jin)一步(bu)的(de)認(ren)識，但由于神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)的(de)復雜性、組織再生能(neng)力的(de)有(you)限性以及血腦屏(ping)障對藥物傳(chuan)送的(de)阻(zu)隔，使用傳(chuan)統(tong)藥物和外(wai)科手術方法治療神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統(tong)類(lei)疾(ji)病仍困難重重。
人腦解剖圖
目前，基(ji)因療(liao)法已(yi)被應(ying)用(yong)于多種疾病的治療(liao)，利(li)用(yong)病毒(du)載體(ti)將遺(yi)傳(chuan)(chuan)物(wu)質傳(chuan)(chuan)遞到(dao)器官周(zhou)圍，并在靶細胞中實(shi)現(xian)特異表達，進而實(shi)現(xian)基(ji)因治療(liao)。在神經科學(xue)研(yan)究(jiu)中，尤其是(shi)在體(ti)實(shi)驗，通(tong)常利(li)用(yong)腺相關病毒(du)工具載體(ti)研(yan)究(jiu)基(ji)因的功(gong)能作用(yong)，那么如何才能更高效地利(li)用(yong)AAV在神經系統進行基(ji)因轉導呢？今天我們就一(yi)起學(xue)習AAV在神經研(yan)究(jiu)中的選(xuan)擇策略。
一、AAV血清型的選擇
據報道，目前適(shi)(shi)用于神(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統的(de)AAV血(xue)清(qing)型(xing)(xing)有：1、2、5、6、8、9、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、DJ、Retro、rh10等(deng)十幾種，不(bu)同(tong)的(de)血(xue)清(qing)型(xing)(xing)在神(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統不(bu)同(tong)部位的(de)感染效(xiao)率及(ji)擴(kuo)散能力不(bu)同(tong)，合(he)適(shi)(shi)的(de)血(xue)清(qing)型(xing)(xing)關(guan)乎基(ji)因(yin)是否能夠實現高效(xiao)穩定表(biao)達，甚至(zhi)關(guan)乎最終的(de)研究結果，因(yin)此綜合(he)標(biao)記的(de)細胞和(he)每種AAV血(xue)清(qing)型(xing)(xing)的(de)特性等(deng)因(yin)素來選擇合(he)適(shi)(shi)的(de)AAV血(xue)清(qing)型(xing)(xing)至(zhi)關(guan)重要(yao)。根據文獻報道，AAV1,2和(he)5在CNS轉導(dao)水(shui)平(ping)有限，且表(biao)現出不(bu)同(tong)的(de)細胞特異性，如AAV1和(he)5能轉導(dao)神(shen)經(jing)(jing)元和(he)膠質細胞，而AAV2只能轉導(dao)神(shen)經(jing)(jing)元。AAV9在CNS中的(de)應用則較為廣泛(fan)，具有強的(de)擴(kuo)散性，且能穿過血(xue)腦屏障（BBB）實現基(ji)因(yin)高表(biao)達。而在外(wai)周神(shen)經(jing)(jing)系(xi)(xi)統中，AAV9、rh10、PHP.S的(de)感染效(xiao)果較好。
接下來(lai)，就來(lai)詳(xiang)細介(jie)紹一下在神經(jing)環路示蹤中幾種常用的(de)AAV血(xue)清型：
1、可逆向示蹤的血清型— AAV2-retro
常見的AAV病毒載體都是順(shun)向(xiang)(xiang)標(biao)記(ji)(ji)，極少能(neng)(neng)(neng)進(jin)行逆行傳遞，這大大限制了AAV載體在(zai)神經(jing)環(huan)路示(shi)(shi)蹤(zong)中(zhong)的應用。直(zhi)到(dao)2016年，研究人員(yuan)在(zai)AAV2的基礎上，通過(guo)定向(xiang)(xiang)進(jin)化的方式改造出(chu)一種具有(you)逆向(xiang)(xiang)示(shi)(shi)蹤(zong)功能(neng)(neng)(neng)的AAV2突變體——AAV2-retro，該載體能(neng)(neng)(neng)夠(gou)在(zai)小鼠大腦(nao)中(zhong)進(jin)行有(you)效的神經(jing)環(huan)路逆向(xiang)(xiang)標(biao)記(ji)(ji)，且其逆行示(shi)(shi)蹤(zong)能(neng)(neng)(neng)力和效率與傳統的逆行示(shi)(shi)蹤(zong)劑相(xiang)當。圖2所示(shi)(shi)為rAAV2-retro的開發過(guo)程(cheng)及應用實例：
rAAV2-retro（逆向非跨突觸標(biao)記）
（Tervo et al., Neuron, 2016）
2、可順向跨單(dan)級突(tu)觸的血清型 — AAV1
2017年張礪教授團隊研(yan)究(jiu)報(bao)道AAV1能(neng)在高滴度條件下呈順(shun)(shun)向跨(kua)(kua)突(tu)(tu)觸(chu)傳播(bo)，與Cre依賴(lai)的(de)報(bao)告系統相結合，可高效和特異性地驅(qu)動Cre依賴(lai)的(de)外源基因在突(tu)(tu)觸(chu)后神經(jing)(jing)元中的(de)表達(da)，以(yi)標(biao)記突(tu)(tu)觸(chu)后神經(jing)(jing)元。2020年該(gai)研(yan)究(jiu)團隊再次深入研(yan)究(jiu)了(le)AAV1順(shun)(shun)向跨(kua)(kua)突(tu)(tu)觸(chu)標(biao)記的(de)作(zuo)用(yong)機(ji)制(zhi)——依賴(lai)于突(tu)(tu)觸(chu)囊泡的(de)釋放，同時揭(jie)示(shi)了(le)其在多種神經(jing)(jing)環(huan)路(lu)中的(de)廣泛應用(yong)，為(wei)AAV1作(zuo)為(wei)順(shun)(shun)向跨(kua)(kua)突(tu)(tu)觸(chu)示(shi)蹤病(bing)毒工具對神經(jing)(jing)元及其投射(she)腦區(qu)進(jin)行標(biao)記提供了(le)諸(zhu)多證據，如圖3所示(shi)。
AAV1順向跨突觸標記(ji)
（Zingg B et al., J Neurosci, 2020）
此外，張礪(li)教授團隊(dui)還證(zheng)實scAAV1-hSyn-Cre相比(bi)AAV1載體(ti)具(ju)有更(geng)優越的順向跨(kua)突觸標(biao)記能(neng)力(li)，可在興奮性、抑制性、神經調質和腦(nao)-脊髓等多種神經環路中有效、特異地(di)標(biao)記單突觸靶神經元及其輸出，從(cong)而解析(xi)不同的功(gong)能(neng)/行為。
3、可跨血(xue)腦屏障的血(xue)清型(xing) — AAV9、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVPHP.S、AAV.CPP.16
血(xue)腦(nao)屏障的(de)(de)存在(zai)對(dui)中樞(shu)神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)(tong)(tong)有很強(qiang)的(de)(de)保護作用，但(dan)同時它(ta)也能(neng)阻(zu)隔藥物(wu)的(de)(de)傳遞(di)和吸(xi)收(shou)，使神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)(tong)(tong)疾病的(de)(de)治療變得異常(chang)困難，研究(jiu)人員(yuan)通過(guo)進一步改造AAV衣(yi)殼，發現(xian)AAV9& AAVPHP.B&AAVPHP.eB&AAVPHP.S可以(yi)(yi)有效介(jie)導(dao)基(ji)因(yin)由外周(zhou)(zhou)向(xiang)中樞(shu)神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)(tong)(tong)的(de)(de)跨(kua)越，繼(ji)而將遺傳物(wu)質(zhi)遞(di)送至大(da)腦(nao)或脊髓中。研究(jiu)結(jie)果顯(xian)示，AAV-PHP.B可以(yi)(yi)有效地(di)轉導(dao)成年小鼠(shu)大(da)腦(nao)和脊髓的(de)(de)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元(yuan)，AAV-PHP.eB降低了(le)誘導(dao)大(da)多數中樞(shu)神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)(tong)(tong)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元(yuan)所需(xu)的(de)(de)病毒載(zai)量，而AAV-PHP.S顯(xian)示出對(dui)周(zhou)(zhou)圍神(shen)(shen)經(jing)(jing)元(yuan)的(de)(de)更好(hao)趨向(xiang)性(xing)。總之，這些AAV變體(ti)可以(yi)(yi)有效介(jie)導(dao)基(ji)因(yin)由外周(zhou)(zhou)向(xiang)中樞(shu)神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)(tong)(tong)的(de)(de)跨(kua)越，更好(hao)地(di)應用于神(shen)(shen)經(jing)(jing)環路研究(jiu)。
AAV9& AAVPHP.B& AAVPHP.eB& AAVPHP.S有(you)效介導基(ji)因由外周至中樞(shu)神經系統的跨越
(Ken Y Chanet al., Nat Neurosci, 2017)
美國哈(ha)佛大學(xue)(xue)聯合武(wu)漢大學(xue)(xue)人民醫(yi)院研(yan)(yan)究(jiu)團隊(dui)利用合理性(xing)設計的(de)(de)方法(fa)，將選定的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)穿(chuan)透肽(tai) CPP（一 組可(ke)(ke)(ke)以穿(chuan)過(guo)細(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)或(huo)組織屏(ping)障(zhang)的(de)(de)短肽(tai)）分(fen)別插入(ru) AAV9 衣(yi)殼（Q588 和(he) A589 之間(jian)）生(sheng)成突(tu)變體(ti)庫， 將包裝好(hao)的(de)(de) AAV 突(tu)變體(ti)通過(guo)靜脈注射至小(xiao)(xiao)鼠體(ti)內，經(jing)(jing)(jing)過(guo)序列優化(hua)和(he)篩選測(ce)試，得到血腦(nao)屏(ping)障(zhang)穿(chuan)透性(xing)顯著優于(yu)(yu) AAV9 的(de)(de) AAV.CPP.16。通過(guo)在(zai)不同(tong)品系(xi)小(xiao)(xiao)鼠和(he)食蟹猴動(dong)物模型(xing)中進行(xing)驗證，發(fa)現靜脈注射AAV.CPP.16 可(ke)(ke)(ke)以高效跨越(yue)血腦(nao)屏(ping)障(zhang)，感染 CNS 神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)元細(xi)胞(bao)(bao)、星形膠質細(xi)胞(bao)(bao)以及脊髓運(yun)動(dong)神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)元。基于(yu)(yu)小(xiao)(xiao)鼠與食蟹猴研(yan)(yan)究(jiu)結果發(fa)現，系(xi)統給藥 AAV.CPP.16 仍(reng)可(ke)(ke)(ke)感染肝臟(zang)、肌肉、心(xin)臟(zang)等外周臟(zang)器，但(dan)在(zai)檢查(cha)的(de)(de)組織中均(jun)未觀察到明顯的(de)(de)病理反應，也未引起背(bei)根神(shen)(shen)經(jing)(jing)(jing)節(jie)退化(hua)變性(xing)。重要的(de)(de)是，研(yan)(yan)究(jiu)人員發(fa)現AAV.CPP.16 可(ke)(ke)(ke)用于(yu)(yu) GBM 小(xiao)(xiao)鼠模型(xing)的(de)(de)基因(yin)治療，并(bing)具有持久(jiu)高效的(de)(de)抗腫瘤作(zuo)用。
AAV.CPP.16 對食蟹猴(hou)的腦(nao)部轉導效率顯著優于AAV9
啟(qi)動子：CAG 實驗動物(wu)：新生食(shi)蟹猴(hou)(3 月(yue)齡)/ 成年食(shi)蟹猴(hou)(3-4 歲)
注(zhu)射(she)方式：靜脈注(zhu)射(she) 病毒用(yong)量：新生食(shi)蟹猴 2×10E13vg/kg，成年食(shi)蟹猴 5×10E13vg/kg
（Yao et al., Nat Biomed Eng, 2022）
4、可高效靶向神經元細胞的血清型—AAV.CAP-B10
加(jia)州理工學(xue)院的 Viviana Gradinaru 團隊通過對 AAV9 進行衣殼(ke)改(gai)造，開(kai)發了一系列 AAV 變體，其中AAV.CAP-B10，靜脈注射后，不(bu)(bu)僅能夠突破血(xue)腦屏障(zhang)，高效靶向神經(jing)元細胞，同時不(bu)(bu)會在肝(gan)臟(zang)富集(ji)。
該研究團隊對(dui)比了(le)(le)不同(tong) AAV 血清(qing)型通過(guo)靜脈(mo)注射在各組織(zhi)器(qi)官中(zhong)的(de)遞送效率，結(jie)果(guo)發現(xian)，AAV. CAP-B10 表現(xian)出對(dui)中(zhong)樞神(shen)經系(xi)統(tong)的(de)特異性，高度靶向(xiang)神(shen)經元(yuan)細(xi)胞，對(dui)肝臟具有低靶向(xiang)性，這一結(jie)果(guo)不僅在小鼠(shu)上得到了(le)(le)證實(shi)，在非人(ren)靈長(chang)類動(dong)物狨猴上也(ye)得到了(le)(le)證實(shi)。這為腦研究工作(zuo)者提(ti)供了(le)(le)新的(de)工具策略，同(tong)時這也(ye)為腦部疾病提(ti)供了(le)(le)一種(zhong)更安全(quan)、有效的(de)治療(liao)選擇。
AAV.CAP-B10 高效(xiao)靶向小鼠(shu)腦(nao)組織而非肝臟
啟動(dong)子：CAG 實驗(yan)動(dong)物：雄性 C57BL/6J 小鼠(shu)
注(zhu)射(she)(she)方式(shi)：靜脈(mo)注(zhu)射(she)(she) 病(bing)毒用(yong)量：5×1011VG/mice
（David Goertsen et al., Nature Neuroscience, 2022）
在狨猴中，AAV.CAP-B10 特異性靶向神經元
啟動(dong)子：CAG；實驗動(dong)物：成年(nian)狨猴；
注(zhu)射方式：靜脈注(zhu)射；病毒用量：7×1013VG/KG
（David Goertsen et al., Nature Neuroscience, 2022）
5、可高效靶向星形膠質細胞的血清型—rAAV11
星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質細胞(bao)是中樞神(shen)(shen)經系統損(sun)(sun)傷(shang)的(de)(de)關(guan)鍵(jian)反應細胞(bao)，在(zai)脊髓損(sun)(sun)傷(shang)的(de)(de)發(fa)病(bing)(bing)機(ji)制中發(fa)揮著重(zhong)(zhong)要作用(yong)。星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質細胞(bao)功(gong)能障(zhang)礙已被(bei)證實(shi)是腦卒中、阿爾茨海默病(bing)(bing)、帕金森(sen)病(bing)(bing)和亨廷頓病(bing)(bing)等(deng)神(shen)(shen)經退行(xing)(xing)(xing)性疾(ji)病(bing)(bing)的(de)(de)核心(xin)特(te)征。中科院徐富(fu)強團隊對(dui)一(yi)系列(lie)工(gong)具病(bing)(bing)毒(du)進行(xing)(xing)(xing)改造和篩選(xuan)，開發(fa)了一(yi)種新的(de)(de)高效逆(ni)行(xing)(xing)(xing)靶向投射神(shen)(shen)經元(yuan)的(de)(de)重(zhong)(zhong)組(zu)腺相關(guan)病(bing)(bing)毒(du) rAAV11。研究(jiu)發(fa)現(xian)(xian)，rAAV11 可以高效逆(ni)行(xing)(xing)(xing)靶向投射神(shen)(shen)經元(yuan)，且不表現(xian)(xian)出(chu)順行(xing)(xing)(xing)跨突觸特(te)征；rAAV11 還具備優(you)秀的(de)(de)逆(ni)行(xing)(xing)(xing)標記效率，能示蹤 rAAV2 難以轉導的(de)(de)投射神(shen)(shen)經元(yuan)。值(zhi)得注意的(de)(de)是，rAAV11 可以高效且特(te)異(yi)性靶向星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質細胞(bao)，為星(xing)(xing)形膠(jiao)(jiao)質細胞(bao)的(de)(de)研究(jiu)提供了更(geng)加有力的(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)工(gong)具。
rAAV11 靶向星形(xing)膠質細胞
啟動子(zi)：GfaABC1D；實驗動物：C57BL/6J 小鼠；
注射部位：齒狀回（DG）區；病毒(du)用量：2×109 VG/mice
（Han et al., bioRxiv preprint, 2022）
6、可高效靶向小膠質細胞的血清型—AAV-cMG & AAV-MG
北京生(sheng)命科(ke)學研(yan)(yan)究(jiu)所羅敏敏實驗室通過定(ding)向進化策(ce)略，開發了一(yi)系列能夠(gou)在(zai)體(ti)內和體(ti)外(wai)高(gao)效(xiao)(xiao)侵(qin)(qin)染(ran)小(xiao)膠質(zhi)(zhi)細胞的(de)(de)新(xin)型(xing) rAAV 載體(ti)。該研(yan)(yan)究(jiu)針(zhen)對 AAV9 的(de)(de)衣(yi)(yi)殼(ke)(ke)蛋(dan)(dan)白(bai)進行改(gai)造，鑒定(ding)篩選出兩個(ge)衣(yi)(yi)殼(ke)(ke)蛋(dan)(dan)白(bai)（AAV-cMG. WPP 和 AAV-cMG.QRP）能夠(gou)在(zai)一(yi)定(ding)程(cheng)度上提(ti)高(gao) rAAV 病毒對體(ti)外(wai)培養的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)小(xiao)膠質(zhi)(zhi)細胞的(de)(de)侵(qin)(qin)染(ran)效(xiao)(xiao)率。以此為基(ji)礎，研(yan)(yan)究(jiu)團隊針(zhen)對 AAV-cMG.QRP 的(de)(de)插入(ru)肽段及(ji)其在(zai)衣(yi)(yi)殼(ke)(ke)蛋(dan)(dan)白(bai)插入(ru)位點的(de)(de)相鄰氨基(ji)酸進行突(tu)變篩選，成功得到(dao)了高(gao)效(xiao)(xiao)侵(qin)(qin)染(ran)體(ti)外(wai)培養小(xiao)膠質(zhi)(zhi)細胞的(de)(de) AAV-cMG 衣(yi)(yi)殼(ke)(ke)蛋(dan)(dan)白(bai)，同時并不導致小(xiao)膠質(zhi)(zhi)細胞的(de)(de)激(ji)活。
體外篩選得到(dao) AAV-cMG
啟動子：CMV；轉染(ran)細胞(bao)：小膠質細胞(bao)；MOI：104
（Lin et al., Nature Neuroscience, 2022）
研究人員進一步在(zai) AAV-cMG.WPP 基礎之上構建新的 AAV 突(tu)變文庫，并(bing)在(zai)小膠質細(xi)胞特異的 Cx3cr1-CreER 轉基因小鼠(shu)腦內(nei)進行(xing)針(zhen)對性體(ti)內(nei)篩選，成(cheng)功(gong)鑒定得到 AAV-MG1.1 和(he) AAV-MG1.2，能夠在(zai)體(ti)內(nei)高效侵染小膠質細(xi)胞，且不(bu)誘導小膠質細(xi)胞免疫激活。
體內(nei)篩選得(de)到 AAV-MG1.1/1.2 高(gao)效轉導小膠質(zhi)細胞(bao)
啟動(dong)子：CMV；實驗(yan)動(dong)物：Cx3cr1-CreER 轉基因小鼠；
注射(she)部(bu)位：紋狀體（800nl）和中腦（500nl）；
病毒(du)滴度：5×107 vg.μl-1
（Lin et al., Nature Neuroscience, 2022）
這兩類(lei)分(fen)別適用(yong)于(yu)(yu)體外侵染(ran)培養小膠(jiao)(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)（AAV-cMG）和體內侵染(ran)內源性小膠(jiao)(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)（AAV-MG）的(de)新(xin)型(xing) rAAV 載(zai)體，將有助于(yu)(yu)小膠(jiao)(jiao)質(zhi)細(xi)胞(bao)生物學(xue)及相關疾病機(ji)制(zhi)的(de)研究。
7、可高效靶向中樞血管內皮細胞的血清型—AAV-BI30
腦血(xue)(xue)管內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)是(shi)表達在(zai)血(xue)(xue)管腔隙的(de)一(yi)類中樞非神(shen)經元細(xi)胞(bao)群體，作(zuo)為血(xue)(xue)腦屏障的(de)重(zhong)要組成部分，參(can)與(yu)許多(duo)關鍵的(de)生理(li)過程。美(mei)國麻省理(li)工(gong)學院(yuan)-哈佛大(da)學布羅德(de)研究(jiu)所的(de) Benjamin E. Deverman 組和(he)(he)哈佛醫(yi)學院(yuan)的(de) ChenghuaGu組開發(fa)了一(yi)種新的(de)血(xue)(xue)清型 AAV-BI30，可在(zai)多(duo)個鼠(shu)系體內(nei)以及(ji)體外高效轉導內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)。在(zai)相對(dui)較低的(de)全(quan)身(shen)劑量(liang)下，該載體可轉導成年 C57BL/6 小鼠(shu)大(da)腦、視網膜和(he)(he)脊髓血(xue)(xue)管系統中的(de)大(da)多(duo)數(shu)動脈、毛細(xi)血(xue)(xue)管和(he)(he)靜脈內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)。
AAV-BI30 能有效地通過動靜脈(mo)軸轉導大腦內皮細胞
啟(qi)動(dong)子：CAG； 實(shi)驗(yan)動(dong)物：成(cheng)年 C57BL/6J 小鼠；
注射(she)方式(shi)：靜脈注射(she)； 病(bing)毒用量：1×1011 vg/mice
（Krolak et al., NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH,2022）
AAV-BI30 靶(ba)向視網膜和脊髓血管系統的內皮細胞
啟動子：CAG；實驗動物：成年 C57BL/6J 小鼠；
注(zhu)射(she)方式：靜脈注(zhu)射(she)；病毒用量：1×1011 vg/mice
（Krolak et al., NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH, 2022）
此外(wai)，AAV-BI30 在 CNS 中能實現高效的 Cre 介導的基因操縱。AAV-BI30 能高效的在中樞不同類型(xing)血(xue)管(guan)內皮細胞中特(te)異性(xing)表達，適用于神經血(xue)管(guan)生物學相關研究(jiu)，并有助于開發內皮功能障(zhang)礙類疾病的治(zhi)療方法。
二、AAV載體的優化選擇（ssAAV or scAAV）
根據(ju)細胞類型與實驗(yan)目的(de)(de)選擇(ze)好(hao)合(he)(he)適(shi)的(de)(de)血清型后(hou)，還可以(yi)進行實驗(yan)需要(yao)進行AAV載體的(de)(de)優(you)化選擇(ze)。腺(xian)相(xiang)關病毒(du)為單(dan)鏈(lian)DNA病毒(du)（ssAAV）, 在(zai)入核(he)、脫(tuo)衣殼(ke)后(hou)，需要(yao)借助(zhu)宿主DNA聚合(he)(he)酶或者(zhe)分子間退(tui)火完成雙(shuang)鏈(lian)轉化，才能啟動基(ji)因(yin)(yin)(yin)轉錄過(guo)程，這(zhe)一過(guo)程限(xian)制(zhi)了AAV載體介導(dao)(dao)的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)轉導(dao)(dao)，并直(zhi)接(jie)影(ying)響(xiang)病毒(du)的(de)(de)感(gan)染效(xiao)率(lv)。自身互補(bu)雙(shuang)鏈(lian)DNA的(de)(de)腺(xian)相(xiang)關病毒(du)(scAAV)能夠克服這(zhe)一限(xian)制(zhi)，不需要(yao)經歷一個由單(dan)鏈(lian)變(bian)為雙(shuang)鏈(lian)的(de)(de)過(guo)程，也(ye)就是說，雙(shuang)鏈(lian)AAV病毒(du)進入細胞后(hou)，可以(yi)直(zhi)接(jie)表達(da)，并且表達(da)時間更(geng)(geng)快(kuai)(kuai)，表達(da)水平更(geng)(geng)高。因(yin)(yin)(yin)此(ci)，在(zai)神經研(yan)究中(zhong)，也(ye)可以(yi)根據(ju)需要(yao)選擇(ze)scAAV載體，完成目的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)更(geng)(geng)快(kuai)(kuai)表達(da)，或者(zhe)基(ji)因(yin)(yin)(yin)更(geng)(geng)強表達(da)的(de)(de)研(yan)究。
三、啟動(dong)子的(de)選擇
除了(le)AAV載體與血清型，啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)和調控元件的優化也十分必(bi)要。目前(qian)，研究中使(shi)用的廣(guang)譜型啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)，如巨細胞(bao)病毒啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)CMV、CMV增強(qiang)子(zi)(zi)融合的雞?-肌動(dong)(dong)蛋白啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)CAG等，可(ke)(ke)實現(xian)目的基(ji)因(yin)的高表達。四(si)環素(su)啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)TRE作為(wei)(wei)誘導型啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)，則(ze)可(ke)(ke)以(yi)在(zai)特定條(tiao)件下啟(qi)動(dong)(dong)基(ji)因(yin)的表達。然而(er)，神經系統的組成極(ji)其復雜，腦部的精(jing)密研究非常關鍵(jian)，要想實現(xian)某個腦區甚(shen)至是(shi)某一類細胞(bao)的特異性感染，選擇一種特異性相對更強(qiang)的啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(zi)尤為(wei)(wei)重要。
常(chang)見的神經組織特異性啟動子
四、轉錄后調控元件的(de)添加
AAV載體上轉(zhuan)錄(lu)后(hou)調控元(yuan)件(jian)的(de)(de)添加，對于mRNA的(de)(de)剪接及(ji)核輸出(chu)、mRNA的(de)(de)穩定性及(ji)翻譯(yi)等(deng)具(ju)有重(zhong)要意(yi)義，下面列(lie)舉(ju)兩個對于提高外源(yuan)基(ji)因表達非(fei)常重(zhong)要的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)后(hou)調控元(yuan)件(jian)。
1、內含子
真(zhen)核(he)mRNA內(nei)含(han)子在(zai)真(zhen)核(he)生物基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)達調控中(zhong)(zhong)起著重(zhong)要的(de)作用，是轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)研究中(zhong)(zhong)提高(gao)外源(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)達的(de)重(zhong)要元件之一(yi)。在(zai)多(duo)數情(qing)況下(xia)，真(zhen)核(he)mRNA內(nei)含(han)子的(de)存在(zai)可以(yi)(yi)提高(gao)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)表(biao)達水平，因(yin)(yin)為其剪接過(guo)程會影響(xiang)mRNA新陳(chen)代謝的(de)多(duo)個(ge)階段，包括轉(zhuan)(zhuan)錄、RNA編輯、pre-mRNA的(de)加(jia)工、mRNA的(de)出(chu)核(he)運輸、翻(fan)譯等。所以(yi)(yi)說，在(zai)載體容量允(yun)許的(de)情(qing)況下(xia)可添加(jia)一(yi)個(ge)內(nei)含(han)子，有助(zhu)于刺激基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)表(biao)達。
2、WPRE元件
土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列WPRE是一段(duan)順式作(zuo)用的(de)(de)(de)RNA元(yuan)件，放(fang)在多聚腺苷酸化信號之前(qian)可顯著(zhu)增加mRNA的(de)(de)(de)表(biao)達水平和翻譯效率，進而增強基因的(de)(de)(de)表(biao)達，并(bing)且WPRE插入病毒載(zai)體中(zhong)還(huan)可以大大提(ti)升病毒包裝的(de)(de)(de)滴(di)度(du)。然而由于WPRE序列較長（600bp左右），所以還(huan)需要視具體的(de)(de)(de)載(zai)體容量選擇性(xing)插入。
五、注射方式的選擇
目(mu)前AAV在神經(jing)系統(tong)研究中的(de)注(zhu)射(she)(she)(she)(she)方(fang)(fang)法(fa)主(zhu)要有(you)以下幾種：腦實(shi)質內注(zhu)射(she)(she)(she)(she)、靜脈注(zhu)射(she)(she)(she)(she)、腦室(shi)注(zhu)射(she)(she)(she)(she)（ICV）、枕大池內注(zhu)射(she)(she)(she)(she)（ICM）和鞘內注(zhu)射(she)(she)(she)(she)（IT），其中ICV、ICM和IT注(zhu)射(she)(she)(she)(she)是通(tong)過腦脊(ji)髓液(ye)進行(xing)傳遞。每種注(zhu)射(she)(she)(she)(she)方(fang)(fang)式(shi)(shi)各有(you)優(you)缺點，研究者可根據具體的(de)研究對象以及實(shi)驗方(fang)(fang)案(an)，選(xuan)擇適(shi)合的(de)注(zhu)射(she)(she)(she)(she)方(fang)(fang)式(shi)(shi)，推薦進行(xing)預實(shi)驗對實(shi)驗效(xiao)果做初步測試，以得到更優(you)的(de)選(xuan)擇方(fang)(fang)案(an)。
四種常(chang)用AAV神(shen)經給藥(yao)特點
（Ocana-Santero G et al. ，International Journal of Molecular Sciences, 2021）
下面介紹幾種常用注射方法(fa)及相應(ying)的病毒注射劑(ji)量：
（1）腦立體定位注射
腦立體定(ding)位注射，相(xiang)比其他注射方式靶(ba)向性(xing)強，注射病毒體(ti)積小，但是(shi)侵入性(xing)也強，且對操作者具有很(hen)高的(de)要求。在立體(ti)定(ding)位手術(shu)時(shi)，顱骨上常用的(de)注射參照(zhao)點(dian)是(shi)前囟，也就是(shi)中(zhong)矢狀(zhuang)冠狀(zhuang)縫的(de)交(jiao)叉(cha)點(dian)（下(xia)圖B中(zhong)的(de)十字(zi)交(jiao)叉(cha)點(dian)）。具體(ti)操作步驟如下(xia)：
1. 實驗動物稱重，進(jin)行麻醉；
2. 待實驗動物完全麻(ma)醉后，用剃(ti)毛(mao)器將(jiang)動物頭(tou)頂眼睛至耳朵之間的毛(mao)發剃(ti)除干凈(jing)；
3. 將麻(ma)醉后(hou)的(de)實驗(yan)動(dong)物固定于腦立體定位儀上；
具體操(cao)作為(wei)(wei)：實(shi)驗動物眼(yan)部涂抹青(qing)霉素眼(yan)藥膏(gao)以保護其雙眼(yan)；將門齒掛在(zai)門齒掛鉤上(shang)，確保頭部保持(chi)固(gu)定；檢查左(zuo)右(you)耳(er)桿是否(fou)在(zai)同(tong)一水平上(shang)，將左(zuo)右(you)耳(er)桿通過(guo)外耳(er)道插(cha)入實(shi)驗動物耳(er)內。實(shi)驗動物固(gu)定好的標準為(wei)(wei)：鼻對(dui)正(zheng)中，頭部不動，提尾不掉，目(mu)測大(da)腦放(fang)置水平；
4. 手術：用(yong)碘(dian)伏/ 無色葡萄糖氯己定(ding)溶(rong)液對實驗動物(wu)頭皮(pi)進行(xing)消(xiao)毒清理，用(yong)手術刀沿(yan)中間位置剪開(kai)頭皮(pi)，用(yong)鑷子對表(biao)面(mian)的結締組織進行(xing)清理，暴(bao)露實驗動物(wu)的顱骨表(biao)面(mian)；然后(hou)進行(xing)調平，首先找到前囟(xin)這個(ge)坐(zuo)標，并將其(qi)歸(gui)零(ling)，然后(hou)向左(zuo)(zuo)右調平，使(shi)左(zuo)(zuo)右兩側(ce)處(chu)于同(tong)一(yi)水(shui)平，調整前后(hou)囟(xin)，使(shi)前后(hou)囟(xin)也在同(tong)一(yi)水(shui)平；
5. 病(bing)毒注(zhu)射(she)(she)：通過查詢實(shi)(shi)驗(yan)動物的腦立(li)體定(ding)(ding)(ding)(ding)位(wei)圖(tu)譜(pu)確定(ding)(ding)(ding)(ding)待(dai)注(zhu)射(she)(she)腦區的位(wei)置（下方圖(tu)片是大鼠(shu)(shu)和小(xiao)鼠(shu)(shu)的腦譜(pu)），并確定(ding)(ding)(ding)(ding)其坐標值，即ML 值（X 軸）、AP 值（Y 軸）、DV 值（Z 軸）；根據目標腦區設定(ding)(ding)(ding)(ding)好(hao)坐標，移開注(zhu)射(she)(she)針(zhen)，用顱(lu)骨(gu)鉆(zhan)開窗( 由(you)于顱(lu)骨(gu)薄, 故(gu)務必注(zhu)意顱(lu)骨(gu)鉆(zhan)的力度！！), 操作時避免傷(shang)及腦組織；微量注(zhu)射(she)(she)器吸(xi)取(qu)病(bing)毒液，隨后固定(ding)(ding)(ding)(ding)在(zai)定(ding)(ding)(ding)(ding)位(wei)儀(yi)上，根據設好(hao)的坐標進(jin)行病(bing)毒注(zhu)射(she)(she)，注(zhu)射(she)(she)速度控(kong)制在(zai)0.1-0.15μL/min，注(zhu)射(she)(she)劑量視具體實(shi)(shi)驗(yan)而定(ding)(ding)(ding)(ding)。注(zhu)射(she)(she)完畢，留(liu)針(zhen)10min，以便病(bing)毒液充分吸(xi)收，然后慢(man)慢(man)回針(zhen)；
6. 縫合頭皮并(bing)消毒(du), 完成腦(nao)定(ding)位(wei)注(zhu)射; 將(jiang)動物從(cong)腦(nao)立(li)體(ti)定(ding)位(wei)儀(yi)取(qu)下, 回籠(long)待蘇醒(xing); 動物蘇醒(xing)后(hou),正常喂養(yang), 病毒(du)注(zhu)射后(hou)2-4 周可檢(jian)測(ce)轉(zhuan)基因的(de)表達。
提示：若手(shou)術麻醉(zui)時間較長，建議不(bu)要(yao)用酒精消(xiao)毒，防止酒精揮發導致動物體(ti)溫過(guo)(guo)低而死亡(wang)。手(shou)術過(guo)(guo)程和蘇醒過(guo)(guo)程注(zhu)意保暖(nuan)。
腦(nao)立體定(ding)位注射(she)示意圖(tu)
（Van der Perren A et al. JOVE-J VIS EXP. 2016）
（2）鞘內注射
與系(xi)統注(zhu)射和實質內注(zhu)射相比，鞘內給藥是(shi)一種(zhong)具有較低劑量(liang)要求(qiu)的微創替代方法(fa)。步驟如(ru)下：
1、使用毛巾覆(fu)蓋在(zai)小鼠(shu)頭部(bu)(bu)和背部(bu)(bu)，露出髂嵴(ji)以下的(de)(de)腰部(bu)(bu)區(qu)域(yu)；用非慣(guan)用手的(de)(de)拇指(zhi)和食(shi)指(zhi)抓住鼠(shu)的(de)(de)髂骨(髖(kuan)骨)，手的(de)(de)頂部(bu)(bu)輕輕放在(zai)小鼠(shu)身體和頭部(bu)(bu)上，使其保持平靜。
注：在(zai)髂骨上的握力應該足夠強，以(yi)固定小鼠的腿部(bu)活動，并使腿部(bu)向外和向下(xia)伸展(zhan)。
2、使用(yong)慣(guan)用(yong)手(shou)食指從(cong)腰椎到骶部沿脊柱輕輕按壓，同時使用(yong)非慣(guan)用(yong)手(shou)輕輕上(shang)拉小鼠，以打開椎節之(zhi)間的空間，方便進針。
3、將1 ?”號針(zhen)的(de)(de)斜面指向小鼠(shu)頭部，然后將針(zhen)以(yi)70°角(jiao)插(cha)(cha)入(ru)脊(ji)柱中線的(de)(de)腰(yao)椎(zhui)處(chu)，當感覺針(zhen)碰(peng)到骨頭時，將針(zhen)的(de)(de)角(jiao)度調整(zheng)到30°夾角(jiao)，并將針(zhen)插(cha)(cha)入(ru)椎(zhui)節(jie)之(zhi)間。
注：需(xu)多次嘗試找(zhao)到合適的進入(ru)點，針頭進入(ru)脊柱后(hou)推針沒有阻力，尾(wei)巴或后(hou)腿的反射性彈(dan)跳出現時，說明已正確入(ru)針。
4、輕輕壓下(xia)(xia)注射器的活(huo)塞(sai)，將5-10μL的AAV病毒懸液注射至蛛(zhu)網膜下(xia)(xia)腔(qiang)。
注：注射時(shi)間控(kong)制在(zai)10-30s較好，速度(du)太快會(hui)導致小鼠后(hou)腿抽筋(jin)，該現象會(hui)在(zai)60s內(nei)消失。
5、注(zhu)射后，將(jiang)針180°旋轉1-2次，然后將(jiang)針從(cong)脊柱中取出。
6、小鼠(shu)放回(hui)籠子觀察，確(que)認恢(hui)復正(zheng)常運動功能。
注：此(ci)法適用于成(cheng)年(nian)小鼠(shu)或大鼠(shu)。
（3）靜脈注射
系統性給(gei)藥方(fang)式，侵入性較(jiao)小(xiao)，但是相比其(qi)他注射方(fang)式特異(yi)性也較(jiao)差，因(yin)此所需(xu)病毒體(ti)積更大(da)。步(bu)驟如下(xia)：
新生小鼠的顳靜脈注射
1、調整光源位置以便照亮顯微鏡區(qu)域，中等(deng)強度的光照為佳。
2、將一(yi)個新生幼鼠(shu)直接置于(yu)冰上1-3min，進行麻醉(zui)。
3、當動(dong)物在(zai)冰上麻醉時，在(zai)注(zhu)射器中注(zhu)滿AAV病毒，注(zhu)射體積不應超過100μL。
4、在(zai)顯微鏡下(xia)觀察幼(you)(you)鼠。用(yong)不(bu)持注(zhu)射(she)器的手的食指放(fang)在(zai)幼(you)(you)鼠口鼻處，中指放(fang)在(zai)耳芽處，以(yi)便拉伸幼(you)(you)鼠的皮膚，可見(jian)顳淺靜(jing)脈。
5、確定顳淺靜脈(mo)。可通過皮(pi)膚看(kan)到(dao)位于耳芽前部，周圍毛(mao)細血管下(xia)部，有一條隱約可見的靜脈(mo)血管，從(cong)背(bei)部到(dao)腹部，匯入頸靜脈(mo)，這就是顳淺靜脈(mo)。
6、注(zhu)射器針尖(jian)斜面(mian)插(cha)入顳靜脈(mo)。可以看到針尖(jian)斜面(mian)通過皮膚(fu)的(de)以后被血(xue)填充。輕(qing)壓注(zhu)射器，并注(zhu)意幼鼠臉(lian)側面(mian)的(de)靜脈(mo)變白。
成年(nian)小(xiao)鼠眶后靜脈(mo)注射(she)
1、注射(she)異(yi)氟(fu)醚(mi)對小鼠進行(xing)麻醉，使用非慣用手手掌握住小鼠背部(bu)，將(jiang)拇指(zhi)放在氣管正(zheng)側面，頭(tou)部(bu)皮毛攏至手掌，使小鼠眼球(qiu)凸起(qi)。
2、將手(shou)腕支撐在穩(wen)定的表(biao)面上，用拇(mu)指(zhi)(zhi)、中指(zhi)(zhi)和無名指(zhi)(zhi)握住注射器，將食指(zhi)(zhi)放(fang)在柱塞(sai)上方。
3、對(dui)小鼠(shu)施(shi)加輕微壓力(li)使眼睛凸出，針頭(tou)(tou)對(dui)準內眥(zi)，斜面朝外，將(jiang)針頭(tou)(tou)以45°插入眶后(hou)竇中(zhong)心約5mm；
4、使用(yong)0.5ml 28G注射器緩(huan)慢注入150-200μL病毒懸(xuan)液；
5、緩慢地取出針(zhen)頭，確(que)保針(zhen)頭不(bu)會劃傷眼角膜。使用無菌紗布(bu)止血，并在眼睛上涂抹藥膏助其恢復。
6、注(zhu)射后，將小(xiao)鼠放(fang)回籠(long)中恢復(fu)直(zhi)至(zhi)清醒。
成(cheng)年小鼠眶后(hou)靜脈(mo)注射
（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
尾靜脈注射
1、將(jiang)小鼠(shu)放入約束(shu)器中，使尾(wei)巴從開(kai)口處露出。避(bi)免過度限制小鼠(shu)，以免導致其呼吸受(shou)阻。
2、在尾部(bu)涂抹(mo)70%異丙(bing)醇。
3、將(jiang)小鼠(shu)尾(wei)巴拉直(zhi)，可(ke)看(kan)到尾(wei)巴兩(liang)側各(ge)有一條側脈。
4、將針尖以(yi)30°角(jiao)插入側靜(jing)脈中。一旦針尖穿過(guo)了靜(jing)脈的(de)一半，重新(xin)調(diao)整針頭，使其與靜(jing)脈的(de)長度一致(圖3c)。如果針頭插入正確，則按壓注(zhu)射器注(zhu)射時應(ying)無阻力。
5、使用0.5ml 28G注射器緩慢(man)注射300μLAAV病(bing)毒懸液，此(ci)時靜脈顏色(se)會變白，大(da)約4s后，顏色(se)恢復正常。
6、小心將針頭取出，用吸水紗(sha)布按(an)壓(ya)注射(she)部位(wei)10秒進行止血。
7、將小鼠放回籠子。
尾靜脈(mo)注射
（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
小結
值得注意的(de)(de)是，除了以上(shang)所述各項因(yin)(yin)素(su)(su)外，AAV病毒(du)本身的(de)(de)滴度(du)和純度(du)，目的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)本身的(de)(de)自然屬性（如胞內蛋白/分泌(mi)蛋白/轉運蛋白）以及AAV感(gan)染后(hou)所使用的(de)(de)檢(jian)測方法等因(yin)(yin)素(su)(su)也會影響到基(ji)因(yin)(yin)最(zui)終的(de)(de)表達效(xiao)果(guo)。因(yin)(yin)此，在神經系統(tong)研究(jiu)中，想要驅動更高效(xiao)的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)轉導，可(ke)以綜合(he)考慮以上(shang)各項因(yin)(yin)素(su)(su)，優化選擇。
AAV在腦組織中的靶向策略（應用篇）（可點擊查看）
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