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AAV在心臟研究中的靶向策略【干貨篇】

心(xin)血(xue)管(guan)疾(ji)(ji)病(bing)是影(ying)響人(ren)類死亡率的一個(ge)主要原因。近(jin)年來(lai)，基因療法(fa)已成為治療和治愈(yu)受損心(xin)血(xue)管(guan)組織的一種(zhong)有前景的方法(fa)，能夠使心(xin)臟(zang)從無功(gong)能狀態(tai)(tai)恢復到正常狀態(tai)(tai)。AAV可(ke)在(zai)心(xin)臟(zang)組織有效、持(chi)久(jiu)、穩定、安全地表(biao)達(da)外源基因，因而(er)在(zai)心(xin)臟(zang)基因治療策略中占據獨特優勢(shi)。大量動物(wu)實(shi)驗和臨(lin)床數據表(biao)明，通過AAV攜帶治療基因對心(xin)血(xue)管(guan)疾(ji)(ji)病(bing)如心(xin)力(li)衰(shuai)竭(jie)、心(xin)肌(ji)缺血(xue)、心(xin)肌(ji)梗死后心(xin)臟(zang)重構等均有積極(ji)效果。在(zai)使用(yong)rAAV進行(xing)心(xin)臟研究時，正(zheng)確選擇AAV血清型(xing)、啟動子以及(ji)注射方(fang)式(shi)是實(shi)驗順利開展(zhan)的必備條件。今天小(xiao)V就和大家一(yi)起來(lai)學(xue)習一(yi)下AAV在心臟(zang)研究中的優(you)化策略，以提高AAV的基因轉移效率(lv)。

01. 血清型的選(xuan)擇

AAV血清型(xing)多(duo)種多(duo)樣，在心臟研(yan)究中AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和(he)AAV9型(xing)對心臟有較(jiao)好的感染效(xiao)率(lv)，其中AAV8和AAV9的感染(ran)效率較優于其(qi)他血清型，AAV9是目前公認的高效(xiao)特異性靶向心(xin)臟表達(da)的病毒載體血清型。盡管AAV8的(de)感染效果也不錯，但是沒有AAV9的(de)擴散性好。臨床上靶向心肌的(de)AAV血清型一般為1，6和9型，其中AAV1和AAV6均(jun)可(ke)有效靶(ba)向心肌(ji)和骨骼(ge)肌(ji)細胞，而AAV9則更加(jia)傾向于對心肌(ji)的感染(ran)。

圖1.五(wu)種AAV血清(qing)型對心(xin)臟(zang)感(gan)染(ran)效率檢測

圖(tu)2.不(bu)同血清型與不(bu)同病毒量感染心(xin)臟的效果(guo)圖(tu)
（Prasad K et al. Gene Therapy, 2011）

02. 啟動子的選擇

常見的(de)廣譜型啟(qi)動子CMV、CAG即可(ke)在心臟中(zhong)較好(hao)表達，如(ru)果特異(yi)性要求不(bu)高的(de)話(hua)可(ke)以選(xuan)擇CMV啟(qi)動子，其對(dui)心臟(zang)的轉(zhuan)導效率很高。

圖(tu)3. AAV9-CMV與AAV9-CBA介導的心肌(ji)中GFP表(biao)達情況（1w、3w、5w、8w）
(■) CMV; (■) CBA.
（BD Chen et al. Clin Exp Pharmacol Physiol 2015）

若(ruo)要實現目(mu)的(de)基因在心(xin)臟中特異(yi)(yi)性(xing)表達，推薦選擇心(xin)臟特異(yi)(yi)性(xing)的(de)啟動子，如cTNT、αMHC、Des、MLC2v等，其中cTNT和αMHC兩種啟動子(zi)應用(yong)較(jiao)為(wei)廣(guang)泛。

圖4.cTnT啟動(dong)子(zi)在心臟表(biao)達的(de)特異性(xing)更強 （Prasad K,Xu Y, Yang Z,et al. Gene Therapy, 2011）

03. 注射方式的選擇

AAV在心臟的注射(she)方式有多(duo)種，心肌原點注(zhu)射、冠狀動(dong)脈注(zhu)射、頸靜脈注(zhu)射和尾靜脈注(zhu)射均(jun)可(ke)以將藥物(wu)遞(di)送到心臟，通常文(wen)獻報(bao)道(dao)較(jiao)多的是心肌原(yuan)點(dian)注射(she)和尾靜脈注射(she)。

心肌注射：

心肌(ji)注射是通(tong)過注射器(qi)或類(lei)似裝置將藥(yao)物(wu)直接注入(ru)心臟組織，多采(cai)用原位多點注射方式，注射體(ti)積20μL/site，3-5點(dian)注射，通常注射的(de)總病(bing)毒量(liang)在10E11VG以上。與血管注射相比，心(xin)肌直接注射方法特(te)異性較強，可以實現(xian)對感興(xing)趣區域(yu)(yu)的高效轉(zhuan)導，但表(biao)達(da)不均(jun)勻，只在(zai)注射(she)部位周圍的區域(yu)(yu)進行(xing)表(biao)達(da)。

圖5.心(xin)肌注(zhu)(zhu)射（心(xin)外(wai)膜與(yu)(yu)心(xin)內膜途徑）與(yu)(yu)心(xin)包注(zhu)(zhu)射 （Ishikawa K,et al. Journal of Gene Medicine,2011）

尾(wei)靜脈注(zhu)射(she)：

是將小鼠固定后通(tong)過尾(wei)部側面的靜(jing)脈注(zhu)(zhu)射(she)使藥物傳遞到心(xin)臟。尾(wei)靜(jing)脈注(zhu)(zhu)射(she)易于操作，但是特異(yi)性較心(xin)肌注(zhu)(zhu)射(she)稍(shao)弱，注射(she)體(ti)積在100μL-200μL左右，由于載體在全身廣泛(fan)分布，注(zhu)射劑在血容量中會被稀釋(shi)，所以(yi)通常需要較高(gao)的病毒滴度。

頸靜(jing)脈(mo)注射：

頸(jing)靜(jing)脈注射(she)時(shi)，在麻醉(zui)小鼠頸(jing)部做(zuo)切口，并分(fen)離頸(jing)靜(jing)脈，用31G針(zhen)將載體注入頸(jing)靜(jing)脈。此方法需要進行手(shou)術，操作(zuo)要求較高，且對動(dong)物(wu)有傷害(hai)性。頸靜脈注射時，所注射的(de)病毒總(zong)量約為(wei)20μL-100uL。

冠狀(zhuang)動脈注射：

冠狀動脈(mo)注射又分順行(xing)冠狀(zhuang)動(dong)脈注射和逆(ni)行(xing)冠狀(zhuang)動(dong)脈注射。

順(shun)行(xing)冠狀動脈(mo)注射是(shi)通過(guo)導管直接注射載(zai)體，允許(xu)具有心臟選擇性的載體(ti)進行微創(chuang)遞送，由于(yu)其(qi)微(wei)創性該方法具有較大的優(you)勢，已廣泛用于(yu)臨床和實驗基因治療研(yan)究。但(dan)由于(yu)內皮(pi)細(xi)(xi)胞是載體到(dao)達心肌細(xi)(xi)胞的屏障，導致轉導效率相對較低，可以(yi)小劑(ji)量(liang)的持續注入或使用一些藥劑(ji)（如腺苷、組胺類、硝(xiao)酸(suan)甘油等）來增加血(xue)管(guan)床的滲透性進行改善。

圖6.順行(xing)冠狀(zhuang)動脈注(zhu)(zhu)射 A、順行(xing)注(zhu)(zhu)射：通過導管直接注(zhu)(zhu)射載體(ti)；
B、使用V型(xing)聚(ju)焦系統(tong)進行順行注射：注射的載體通過抽吸(xi)導管從冠(guan)狀竇(dou)中(zhong)吸(xi)出，然后再循環到冠(guan)狀動脈中(zhong)；
C、冠狀動脈阻塞的(de)順行注射(she)：將載體(ti)注射(she)到阻斷冠狀動脈血流(liu)的(de)球(qiu)囊(nang)遠(yuan)端
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

逆行冠狀動脈注(zhu)(zhu)射(she)是(shi)通過阻斷(duan)冠狀竇進行壓力調節的逆向輸注(zhu)(zhu)，相比順行注(zhu)(zhu)射(she)更加有效。然而，這(zhe)種方法(fa)需要暫時中斷(duan)冠狀動脈血流，以消除順行血流對(dui)壓力的影響。雖然轉(zhuan)導效率(lv)很高，但創傷(shang)較大，危險性較高。

圖7.通(tong)過冠(guan)(guan)狀竇(dou)逆行(xing)注(zhu)射 A、逆行(xing)注(zhu)射:載(zai)體在冠(guan)(guan)狀動(dong)脈(mo)阻塞時注(zhu)入冠(guan)(guan)狀竇(dou)，冠(guan)(guan)狀竇(dou)的壓(ya)力(li)由導管調節(jie)；
B、冠狀竇直接注射(she)(TransAccess):利用(yong)血(xue)管內超聲引導經靜脈心肌穿刺，載(zai)體(ti)由微導管通過可擴張(zhang)針進行注射(she)
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

幾種常用注(zhu)射方式(shi)的優劣勢比(bi)較

04. 參(can)考文獻

1. Prasad K , Xu Y , Yang Z , et al. Robust Cardiomyocyte-Specific Gene Expression Following Systemic Injection of AAV: In Vivo Gene Delivery Follows a Poisson Distribution[J]. Gene Therapy, 2011, 18(1):43-52.

2. Ishikawa K , Tilemann L , Fish K , et al. Gene delivery methods in cardiac gene therapy[J]. Journal of Gene Medicine, 2011, 13(10):566-572.

3. BD Chen , CH He , XC Chen , et al. Targeting transgene to the heart and liver with AAV9 by different promoters[J]. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2015, 42(10):1108-1117.

AAV在(zai)心臟(zang)研究中的靶向(xiang)策(ce)略【應用篇(pian)】（可(ke)點擊(ji)查看）