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『CircRNA領域新發現』浙江大學范順武教授課題組發現CircRNA :CircSERPINE2,為骨關節炎治療提供有效策略

環狀RNA（circular RNAs，CircRNAs）是一類特殊的非編碼RNA分子，不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構，具有組織特異性和高度保守性，廣泛存在于哺乳動物細胞中。與線性RNA相比，CircRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。一些CircRNAs富含miRNA結合位點，在細胞中可以作為miRNA海綿（miRNA sponge）或競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），自動隔離或競爭性抑制miRNA的(de)活性，進而(er)解除miRNA對其靶基因(yin)的(de)抑制作(zuo)用，提(ti)高(gao)靶基因(yin)的(de)表達水平。最(zui)近不斷(duan)發現circRNA在(zai)不同(tong)研究領(ling)域(yu)和研究方向的(de)新功能，circRNA已成為(wei)RNA研究領(ling)域(yu)的(de)最(zui)新熱點(dian)，吸引著(zhu)無數科研工(gong)作(zuo)者的(de)目光(guang)。

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種由增齡、肥胖、勞損、創傷等諸多因素引起的退行性病變，主要特征是軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生，臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、活動受限和關節畸形等，多發于中老年人。科學家研究發現CircRNA表達水平的改變與OA發生有關，浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院范順武教授帶領的團隊在對OA研究中發現了一種新的CircRNA，（hsa_circ_0008365，命名為CircSERPINE2），CircSERPINE2過表達通過miR-1271 - ERG通路緩解軟骨細胞（HCs）凋亡及促進胞外基質（ECM）的合成代謝，在OA治療中可發揮積極作用。

研究結果

1.CircRNA在正常人體及OA患者組織中的表達

臨床(chuang)OA患者和(he)正(zheng)常(chang)人體組織(zhi)(zhi)進行RNAseq分析，發現OA組CircRNA表(biao)達呈(cheng)現差(cha)異。RT-qPCR分析確(que)定(ding)了25個(ge)表(biao)達差(cha)異最大的(de)(de)(de)CircRNA及14個(ge)下調的(de)(de)(de)CircRNA。作(zuo)者用白細(xi)胞介(jie)素(IL)-1β和(he)腫瘤壞死(si)因子(zi)(TNF)-α處理(li)的(de)(de)(de)的(de)(de)(de)原(yuan)發性人類軟骨(gu)細(xi)胞(HCs)試(shi)驗證實了包含hsa_circ_0008365在內的(de)(de)(de)六種(zhong)CircRNA在OA樣本組織(zhi)(zhi)中表(biao)達下調。Sanger測序(xu)法確(que)定(ding)hsa_circ_0008365是(shi)由Serpine2基因的(de)(de)(de)第二(er)個(ge)至(zhi)第四(si)個(ge)外顯子(zi)環化組成，即5’端剪接位點(dian)和(he)外顯子(zi)3’端相應位點(dian)形成的(de)(de)(de)頭(tou)尾(wei)剪接，因此命名(ming)為CircSERPINE2。

OA患者和正常人體(ti)軟骨(gu)細胞(bao)中(zhong)CircSERPINE2的表達(da)水(shui)平檢測顯示，CircSERPINE2在OA樣本呈表達(da)下調(diao)模(mo)式(shi)，在HCs的細胞(bao)質中(zhong)大量表達(da)（圖1）。

圖1 CircSERPINE2在OA軟骨組織和細胞中的驗證和表達

2.CircSERPINE2調節軟骨細胞的凋亡和ECM代謝

為了(le)評估CircSERPINE2參與了(le)基質降(jiang)(jiang)解酶的(de)(de)調控(kong)，作(zuo)者(zhe)用CircSERPINE2小干擾(rao)RNA轉染HCs，發現(xian)CircSERPINE2表達(da)下調并不影響SERPINE2的(de)(de)mRNA水平，而是(shi)增(zeng)加HCs的(de)(de)凋亡率，CircSERPINE2的(de)(de)過表達(da)可(ke)明顯抑(yi)制(zhi)IL-1β誘導的(de)(de)HCs凋亡率。WB結果(guo)顯示抑(yi)制(zhi)CircSERPINE2的(de)(de)表達(da)增(zeng)加了(le)MMP3、MMP13和(he)ADAMTS4（基質降(jiang)(jiang)解相關酶）的(de)(de)表達(da)，降(jiang)(jiang)低SOX9、COL2A1和(he)aggrecan的(de)(de)表達(da)。IF和(he)RT-qPCR結果(guo)再次證(zheng)實，CircSERPINE2表達(da)的(de)(de)下調顯著影響了(le)HCs和(he)SW1353細胞（人骨肉瘤細胞）中MMP13、ADAMTS4、COL2A1和(he)aggrecan的(de)(de)表達(da)水平，CircSERPINE2的(de)(de)下調促進了(le)HCs和(he)SW1353細胞凋亡和(he)代(dai)謝(xie)過程(cheng)（圖2）。

圖2 CircSERPINE2表達下調誘導軟骨細胞基質降解酶的表達

3.CircSERPINE2是miRNAs的吸附海綿

研(yan)究發現OA組織中有(you)191個(ge)miRNA表(biao)達(da)上調，CircSERPINE2可下調miR-1271和miR-93的(de)(de)表(biao)達(da)。WB結(jie)果顯示miR-1271與基(ji)(ji)質降解(jie)和合成(cheng)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)表(biao)達(da)有(you)關，而miR-1271在10個(ge)OA樣本軟骨(gu)中表(biao)達(da)上調。熒光(guang)素酶(mei)檢(jian)測(ce)和FISH實驗證實CircSERPINE2與miR-1271結(jie)合。miR-1271過表(biao)達(da)的(de)(de)細胞(bao)凋亡(wang)率升高，伴隨MMP3、MMP13和ADAMTS4表(biao)達(da)的(de)(de)增(zeng)強，SOX9、COL2A1和aggrecan表(biao)達(da)的(de)(de)降低。抑制(zhi)miR-1271的(de)(de)表(biao)達(da)時，基(ji)(ji)質降解(jie)和合成(cheng)相關蛋(dan)白(bai)的(de)(de)表(biao)達(da)水平(ping)則與此(ci)相反（圖3）。

圖3 CircSERPINE2作為miR-1271的海綿在HC細胞發揮作用

4.CircSERPINE2通過靶向miR-1271的表達在OA中發揮作用

將(jiang)sh-CircSERPINE2和(he)(he)(he)(he)miR-1271海(hai)綿腺病(bing)毒(du)共(gong)感(gan)染細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。已知下調(diao)CircSERPINE2的(de)表達(da)(da)可(ke)增加HC的(de)凋亡(wang)率，而抑制miR-1271和(he)(he)(he)(he)CircSERPINE2的(de)表達(da)(da)可(ke)顯著(zhu)挽救HC的(de)凋亡(wang)率。與單(dan)獨(du)感(gan)染sh-CircSERPINE2和(he)(he)(he)(he)miR-1271海(hai)綿腺病(bing)毒(du)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)相(xiang)(xiang)比(bi)，共(gong)感(gan)染sh-CircSERPINE2和(he)(he)(he)(he)miR-1271海(hai)綿腺病(bing)毒(du)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中，MMP13、MMP3和(he)(he)(he)(he)ADAMTS4的(de)蛋白和(he)(he)(he)(he)mRNA水(shui)平(ping)顯著(zhu)降低(di)(di)，SOX9、COL2A1和(he)(he)(he)(he)aggrecan的(de)蛋白和(he)(he)(he)(he)mRNA水(shui)平(ping)則顯著(zhu)提高。IF結果顯示與用(yong)CircSERPINE2抑制劑處理(li)過(guo)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)相(xiang)(xiang)比(bi)，CircSERPINE2和(he)(he)(he)(he)miR-1271表達(da)(da)抑制劑處理(li)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中，COL2A1和(he)(he)(he)(he)aggrecan表達(da)(da)水(shui)平(ping)升高，而MMP13和(he)(he)(he)(he)ADAMTS4表達(da)(da)水(shui)平(ping)降低(di)(di)，表明CircSERPINE2在(zai)體外通過(guo)靶向miR-1271發揮作用(yong)（圖(tu)4）。

圖4 miR-1271表達下調逆轉HC細胞CircSERPINE2誘導的軟骨降解

5.miR-1271直接作用于ETS相關基因

miR-1271和(he)(he)CircSERPINE2作用靶點研究發(fa)現E26轉(zhuan)化特異性相關(guan)基因（ERG）對COL2A1、aggrecan、MMP3和(he)(he)MMP13表(biao)達(da)水平(ping)的(de)(de)影響最為明顯，在(zai)OA受損軟(ruan)骨區域(yu)顯著下調。ERG是miR-1271的(de)(de)一個預測靶標(biao)，熒(ying)光素酶檢測結果(guo)顯示(shi)，miR-1271 mimic明顯抑(yi)制轉(zhuan)染WT ERG 3 ' -UTR細胞的(de)(de)熒(ying)光素酶活性，降低(di)ERG的(de)(de)蛋白和(he)(he)mRNA表(biao)達(da)水平(ping)，而miR-1271 inhibitor則顯示(shi)出(chu)相反的(de)(de)作用。ERG過表(biao)達(da)降低(di)MMP3、MMP13和(he)(he)ADAMTS4的(de)(de)表(biao)達(da)，提高SOX9和(he)(he)COL2A1的(de)(de)表(biao)達(da)，表(biao)明miR-1271確(que)實(shi)靶向ERG，內(nei)源性ERG表(biao)達(da)與(yu)OA發(fa)病機制密切相關(guan)。

Pre-miR-1271腺病毒感(gan)染抑制ERG的表(biao)達(da)(da)，明顯降(jiang)低(di)HCs中COL2A1、SOX9和aggrecan的表(biao)達(da)(da)，增(zeng)加MMP3、MMP13和ADAMTS4的表(biao)達(da)(da)，ERG過(guo)表(biao)達(da)(da)后這些(xie)作用被消(xiao)除。表(biao)明miR-1271過(guo)表(biao)達(da)(da)通過(guo)調節ERG損害(hai)軟骨(gu)表(biao)型（圖5）。

圖5 ERG是miR-1271的直接靶點，介導miR-1271在HC細胞中的功能

6.注射CircSERPINE2可緩解OA兔的癥狀

為了確定CircSERPINE2是否在體內OA的進展中發揮作用，作者將WT或MUT腺相關病毒(AAV) CircSERPINE2（由維真生物構建和包裝）通過關(guan)(guan)節內注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)入(ru)前(qian)交叉韌帶橫(heng)切(qie)(ACLT)誘導的(de)OA兔(tu)體內。結果顯(xian)(xian)(xian)示(shi)OA兔(tu)在注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)WT AAV CircSERPINE2后軟骨(gu)表面得到了(le)改(gai)善，而(er)(er)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)MUT AAV CircSERPINE2則無改(gai)善。國際骨(gu)關(guan)(guan)節炎研究協會(OARSI)評(ping)分(fen)(fen)顯(xian)(xian)(xian)示(shi)，WT AAV CircSERPINE2顯(xian)(xian)(xian)著降(jiang)低(di)了(le)OARSI評(ping)分(fen)(fen)，而(er)(er)MUT AAV CircSERPINE2則提高(gao)了(le)OARSI評(ping)分(fen)(fen)。顯(xian)(xian)(xian)微CT圖像顯(xian)(xian)(xian)示(shi)OA兔(tu)骨(gu)贅(zhui)增(zeng)加，而(er)(er)關(guan)(guan)節內注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)CircSERPINE2的(de)OA兔(tu)骨(gu)贅(zhui)減(jian)少。免疫組化和WB結果顯(xian)(xian)(xian)示(shi)，注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)WT AAV CircSERPINE2減(jian)輕兔(tu)OA模型(xing)軟骨(gu)基質的(de)退行性變化，如細胞(bao)凋(diao)亡增(zeng)強和分(fen)(fen)解代謝反應增(zeng)強，ECM組成(cheng)增(zeng)加。綜上所述，CircSERPINE2的(de)升(sheng)高(gao)在抑制(zhi)ECM分(fen)(fen)解代謝、促進合成(cheng)代謝和減(jian)輕體內OA方面具有積極作用（圖6）。

圖6 CircSERPINE2減輕OA兔癥狀

小結

本研究(jiu)發現circRNA：CircSERPINE2 通過SERPINE2基因第2個(ge)(ge)至第4個(ge)(ge)外顯子反向(xiang)拼接(jie)產生，其(qi)序列在人與(yu)兔之間較(jiao)為(wei)保守，是一(yi)個(ge)(ge)參與(yu)OA的關(guan)鍵(jian)下調circRNA；CircSERPINE2含有保守的miR-1271靶(ba)(ba)點(dian)，miR-1271在OA中的表達(da)顯著上調，且(qie)與(yu)SOX9、aggrecan和COL2A1的表達(da)呈(cheng)負相(xiang)關(guan)， CircSERPINE2通過靶(ba)(ba)向(xiang)miR-1271-ERG途徑抑(yi)制HCs凋亡，促進ECM合成并抑(yi)制ECM分解(jie)代謝，發揮抗(kang)OA作用。CircSERPINE2-miR-1271-ERG軸將(jiang)成為(wei)預防(fang)和治療(liao)OA的新靶(ba)(ba)點(dian)。