當前位置：首頁 > 研究領域 > 其他
文章標題： ALKBH5 in mouse testicular Sertoli cells regulates Cdh2 mRNA translation to maintain blood–testis barrier integrity
發表期刊： Cellular & Molecular Biology Letters（IF=8.702）
合作客戶： 中國醫學(xue)科學(xue)院北京協和醫院
| 實驗動物 | 雄性C57BL/6J小鼠（2月齡） |
|---|---|
| 病毒產品 | AAV8-shALKBH5-GFP & AAV8-SC-GFP |
| 注射部位 | 睪丸生精小管 |
睪(gao)丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)構成的血液-睪(gao)丸(wan)屏(ping)障（BTB）對于維持精(jing)子產生的獨特微環(huan)境至關重(zhong)要。去甲基化酶ALKBH5在(zai)小鼠睪(gao)丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)中(zhong)大量表達，并以m6A依賴的方式調(diao)節(jie)精(jing)子產生，但(dan)目前尚不(bu)清(qing)楚ALKBH5是否(fou)參與(yu)BTB的調(diao)節(jie)。在(zai)本(ben)研究中(zhong)作者(zhe)利(li)用AAV8 -shALKBH5構建了睪(gao)丸(wan)支(zhi)持細胞(bao)特異性ALKBH5敲低小鼠，用以探(tan)討ALKBH在(zai)BTB中(zhong)的功能，發現ALKBH5通過調(diao)控(kong)Cdh2 mRNA翻(fan)譯來調(diao)節(jie)BTB完(wan)整性。
作者通過前期(qi)研究發現ALKBH5在小鼠(shu)睪丸支(zhi)持細胞(bao)中(zhong)大量表(biao)達，為(wei)了闡明(ming)支(zhi)持細胞(bao)ALKBH5與(yu)BTB之間的(de)聯(lian)系，作者利用AAV8-shALKBH5構建了支(zhi)持細胞(bao)ALKBH5特異性敲(qiao)低小鼠(shu)模型，BTB完(wan)整(zheng)性測定表(biao)明(ming)，ALKBH5敲(qiao)低小鼠(shu)的(de)曲精(jing)小管(guan)BTB完(wan)整(zheng)性受損(sun)，但(dan)對照小鼠(shu)的(de)曲精(jing)小管(guan)中(zhong)BTB未受損(sun)，表(biao)明(ming)支(zhi)持細胞(bao)中(zhong)的(de)ALKBH5參與(yu)BTB完(wan)整(zheng)性的(de)調(diao)節。
ALKBH5主要通(tong)過(guo)m6A（mRNA N6-腺苷酸甲(jia)基(ji)化）調控基(ji)因表達，為了研(yan)究(jiu)ALKBH5調控BTB完整(zheng)性的(de)(de)機制，作者將小鼠支持(chi)細胞TM4中的(de)(de)ALKBH5進行沉(chen)默及(ji)m6A-seq分析。發現ALKBH5表達降(jiang)低(di)后總(zong)體(ti)m6A水平(ping)增加(jia)，并鑒定出(chu)1416個(ge)高(gao)甲(jia)基(ji)化RNA和615個(ge)低(di)甲(jia)基(ji)化RNA，其中一(yi)些基(ji)因集與形成BTB的(de)(de)細胞骨(gu)架(jia)相關。通(tong)過(guo)進一(yi)步的(de)(de)篩選發現ALKBH5沉(chen)默導(dao)致Cdh2 mRNA的(de)(de)m6A水平(ping)顯著增加(jia)，其中Cdh2 mRNA編碼BTB中的(de)(de)一(yi)種(zhong)重要結構蛋(dan)白N-鈣粘蛋(dan)白，m6A IP qPCR實(shi)驗再次證實(shi)這一(yi)結果，此(ci)外作者還發現Cdh2 mRNA與ALKBH5蛋(dan)白結合，表明Cdh2 mRNA是支持(chi)細胞中ALKBH5的(de)(de)去甲(jia)基(ji)化底(di)物。
多聚體分(fen)析結果表(biao)明，沉默ALKBH5后Cdh2 mRNA翻譯效(xiao)率(lv)呈上升趨勢(shi)，但沒(mei)有觀(guan)察到Cdh2 mRNA含(han)(han)量和選(xuan)擇性剪接(jie)方(fang)式(shi)的(de)(de)變化(hua)。因(yin)此，作者測(ce)定翻譯相關(guan)的(de)(de)m6A結合蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)與Cdh2 mRNA之間的(de)(de)關(guan)系(xi)，發(fa)現Cdh2 mRNA和IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3之間存在強(qiang)烈相互作用，同(tong)時Igf2bp1, Igf2bp2及Igf2bp3的(de)(de)沉默均導致(zhi)N-鈣粘(zhan)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)含(han)(han)量顯(xian)著降(jiang)低，Western blot實(shi)驗(yan)發(fa)現N-鈣粘(zhan)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)表(biao)達在沉默Alkbh5后上調。這(zhe)些(xie)結果表(biao)明：ALKBH5通(tong)過(guo)調節(jie)Cdh2 mRNA的(de)(de)m6A水平，并(bing)在IGF2BP1/2/3幫(bang)助(zhu)下(xia)影響其翻譯效(xiao)率(lv)。N-鈣粘(zhan)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)是基(ji)(ji)底內質特化(hua)的(de)(de)重要結構分(fen)子，Alkbh5敲除小鼠(shu)睪(gao)丸(wan)中(zhong)的(de)(de)基(ji)(ji)底內質特異性肌動(dong)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)束嚴(yan)重紊亂，表(biao)明小鼠(shu)睪(gao)丸(wan)支持細胞(bao)中(zhong)的(de)(de)ALKBH5通(tong)過(guo)調節(jie)Cdh2 mRNA翻譯效(xiao)率(lv)，以調控血(xue)液-睪(gao)丸(wan)屏障(zhang)的(de)(de)完整(zheng)性。
本(ben)研究發現，ALKBH5調(diao)(diao)節小鼠睪丸支持細胞Cdh2 mRNA的m6A水平，影響Cdh2 mRNA翻譯效率(lv)，并通過N-鈣粘(zhan)蛋白參(can)與調(diao)(diao)節基(ji)底內質(zhi)特化，繼而調(diao)(diao)控BTB的完整性。
