AAV在內耳的靶向應用策略（下）
AAV載體憑(ping)借其高安全性(xing)，低免疫原性(xing)等優(you)勢，可(ke)以(yi)安全地轉導中(zhong)(zhong)樞(shu)神(shen)經系(xi)統(tong)和(he)感官系(xi)統(tong)，并在(zai)多種疾病的基因治療中(zhong)(zhong)顯示出巨大潛力，這(zhe)為遺傳(chuan)性(xing)耳聾的治愈帶來了新的希望。目前，已有(you)多項研(yan)究表(biao)明，使用AAV作為基因治療載體可(ke)以(yi)部(bu)分或(huo)完全恢復遺傳(chuan)性(xing)耳聾小鼠模型的聽力。上期內(nei)容，我們分享了關于AAV在(zai)內(nei)耳應(ying)用中(zhong)(zhong)的啟動(dong)子(zi)和(he)注射方式的選(xuan)擇(ze)策(ce)略：，本期我們(men)將繼續分(fen)享內(nei)耳應用(yong)中AAV血清型、載體的選擇和優秀(xiu)案例。
一、AAV血清型選擇
1、新生小鼠
①傳統AAV血清(qing)型中，AAV1是(shi)新生小鼠內耳基因(yin)傳遞(di)使用最廣(guang)泛的血清(qing)型之一，可(ke)轉導毛細胞、支持(chi)細胞、血管紋、前庭神(shen)經上皮多(duo)種細胞類型，并(bing)且通過圓(yuan)窗膜(mo)注(zhu)射方(fang)式可(ke)高效轉導內毛細胞。其(qi)它血清(qing)型AAV2、AAV6、AAV8、AAV9以不同的效率感染(ran)新生小鼠耳蝸(gua)內毛細胞（圖1）。
圖1. 相比(bi)其它天然AAV，AAV1在體(ti)外可高效轉導離體(ti)培(pei)養(yang)的小鼠耳(er)蝸毛細胞
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
②與傳統的(de)AAV血(xue)清型相比，變體(ti)Anc80L65可介導(dao)靶基因(yin)在新生小(xiao)鼠(shu)外(wai)毛細(xi)胞(bao)和內毛細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)高(gao)效穩定傳遞（圖2）。
圖2. 相比傳統AAV血清型，Anc80L65在體外可高效轉導小鼠耳蝸外毛細胞和內毛細胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
圖3. 相比(bi)傳(chuan)統AAV血清型，Anc80L65在體內(nei)可高效(xiao)轉導新(xin)生(sheng)小鼠耳蝸內(nei)毛和外毛細胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
③經后(hou)(hou)半(ban)規管注射(she)后(hou)(hou)，變體AAV2.7m8可(ke)在體內高(gao)效轉導新生(sheng)小鼠外(wai)(wai)毛(mao)細胞(bao)和(he)內毛(mao)細胞(bao)，并且在外(wai)(wai)毛(mao)細胞(bao)轉導方面(mian)明顯優于Anc80L65（圖4）。此外(wai)(wai)，AAV2.7m8還能夠(gou)感染支(zhi)(zhi)持(chi)細胞(bao)亞(ya)群(內柱細胞(bao)和(he)內指細胞(bao))(圖5），這些(xie)支(zhi)(zhi)持(chi)細胞(bao)亞(ya)群被(bei)認為能夠(gou)高(gao)效促進毛(mao)細胞(bao)再生(sheng)。
圖4. AAV2.7m8在(zai)體內高效(xiao)感(gan)染新生小鼠耳蝸外毛細(xi)胞(bao)和(he)內毛細(xi)胞(bao)
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
圖5. AAV2.7m8在體內(nei)高效感染新(xin)生小鼠內(nei)耳支(zhi)持細胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
④經(jing)胞(bao)囊(nang)注射后，相比Anc80L65和AAV2.7m8，AAV9-PHP.B在(zai)內(nei)毛(mao)細胞(bao)和外(wai)毛(mao)細胞(bao)中(zhong)均具有強的(de)轉導效(xiao)率，并在(zai)螺(luo)旋和前庭神經(jing)節神經(jing)元中(zhong)顯著(zhu)轉導。
圖6. AAV9-PHP.B在體(ti)內高(gao)效(xiao)感(gan)染新生小鼠耳蝸外毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)和內毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)
（Lee J, et al. Hear Res. 2020）
⑤通過RWM注射，新型突(tu)變體AAV-ie-K558R可(ke)以強烈誘導新生(sheng)小鼠耳蝸中HC樣細胞(bao)的再生(sheng)
圖7. AAV-ie-K558R-Atoh1可在新生小鼠體內再生HC樣細胞
（Tao Y, et al.Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022）
2、成年小鼠
在成年(nian)小鼠中，相比于(yu)AAV1、AAV8、AAV9和Anc80L65血清型，AAV2可同時高效(xiao)轉導內毛(mao)細胞(bao)和外毛(mao)細胞(bao)，其(qi)次(ci)是(shi)Anc80L65血清型（圖8）。
圖8. AAV2高(gao)效(xiao)轉導成年小鼠(shu)耳蝸毛細胞
（Omichi R, et al.Mol Ther Methods Clin Dev. 2020）
二、雙AAV載體選擇
AAV有限的(de)(de)(de)包(bao)裝容量(liang)（約4.7kb）使其無(wu)法遞(di)(di)送一些較大(da)的(de)(de)(de)基因(yin)，這在一定程度上限制了其疾病治療范圍，雙AAV（或(huo)三AAV）載(zai)體(ti)(ti)(ti)技術(shu)的(de)(de)(de)發展(zhan)解決了這一難題。雙AAV載(zai)體(ti)(ti)(ti)遞(di)(di)送策略即將要遞(di)(di)送的(de)(de)(de)大(da)片段基因(yin)拆分(fen)并包(bao)裝到兩個AAV載(zai)體(ti)(ti)(ti)上，其中一個AAV載(zai)體(ti)(ti)(ti)攜(xie)帶啟動子元件(jian)和5’端(duan)外源基因(yin)CDS，另(ling)外一個AAV載(zai)體(ti)(ti)(ti)攜(xie)帶3’端(duan)外源基因(yin)CDS和polyA尾巴(ba)，載(zai)體(ti)(ti)(ti)兩端(duan)為(wei)ITR序(xu)列。將這兩個AAV載(zai)體(ti)(ti)(ti)共(gong)感染目的(de)(de)(de)細胞后，外源基因(yin)的(de)(de)(de)上下游部(bu)分(fen)根據AAV基因(yin)組(zu)的(de)(de)(de)聚合能(neng)力進行重(zhong)組(zu)，最終產生一個包(bao)含完整(zheng)外源基因(yin)的(de)(de)(de)mRNA轉錄本。目前常用的(de)(de)(de)雙AAV載(zai)體(ti)(ti)(ti)策略有三種(zhong)：overlapping、trans-splicing和hybrid。
圖9. 雙AAV載體策略示意圖
（Omar Akil. Hearing Research. 2020）
使用(yong)(yong)雙AAV載體遞送技(ji)術(shu)，可(ke)以將超過(guo)4 kb的(de)編碼序列(lie)(lie)轉(zhuan)導(dao)到內耳(er)，這(zhe)為(wei)一系列(lie)(lie)由較大基因引起的(de)遺傳性(xing)耳(er)聾的(de)基因治(zhi)療(liao)開辟了(le)(le)可(ke)能性(xing)。例如(ru)，研(yan)究人員利用(yong)(yong)雙AAV載體方法在(zai)DFNB9耳(er)聾小鼠模型中成功(gong)實現(xian)(xian)了(le)(le)Otof基因cDNA編碼序列(lie)(lie)（～6 kb）的(de)完(wan)整表(biao)達，實現(xian)(xian)轉(zhuan)導(dao)細胞中Otof基因表(biao)達的(de)持久恢(hui)復和耳(er)聾表(biao)型的(de)逆轉(zhuan)，而(er)且該治(zhi)療(liao)方法不僅可(ke)以在(zai)聽力發作前預防(fang)Otof-/-小鼠的(de)耳(er)聾，而(er)且在(zai)聽力發作后給藥(yao)還可(ke)以持續(xu)逆轉(zhuan)耳(er)聾表(biao)型，這(zhe)為(wei)未來在(zai)DFNB9患者中進行基因治(zhi)療(liao)試驗帶來了(le)(le)希望。
圖10. 雙AAV載體恢(hui)復P10 Otof - /- 小鼠otoferlin表達(da)并預(yu)防耳聾
（Akil O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019）
· 小結 ·
不同的(de)(de)啟動子(zi)、注射方式(shi)(shi)、血清型、病毒用量及載體遞(di)送(song)形(xing)式(shi)(shi)等因素均會(hui)影響(xiang)AAV在內耳的(de)(de)基因遞(di)送(song)效(xiao)率，因此以上(shang)數據(ju)僅供參考(kao)，建議您(nin)在具體實驗(yan)之前(qian)查閱相關文獻或技術資料，選擇合(he)適的(de)(de)策略開展實驗(yan)。
三、優秀案例分享
文章題目(mu)：Template-independent genome editing in the Pcdh15av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness
合作客戶：北(bei)京(jing)腦(nao)(nao)科(ke)學與類腦(nao)(nao)研究中心熊(xiong)巍(wei)教(jiao)授課題組
發表期刊：Cell Reports（IF9.995）
維真生物AAV2/9病毒(du)感染(ran)耳蝸毛細胞效果圖
參考來(lai)源
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