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關于『細胞自噬』，你了解多少？

1.細胞自噬簡介

細胞自噬（autophagy=self-eating）意為自體吞噬，是真核細胞在細胞自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）的調控下利用溶酶體降解自身細胞質蛋白和受損細胞器的過程。細胞自噬可防止細胞損傷，促進細胞在營養缺乏的情況下存活，并對細胞毒性刺激作出反應。細胞自噬包括生理條件下的基礎型細胞自噬和應激條件下的誘導型細胞自噬。前者是細胞的自我保護機制，有益于細胞的生長發育，保護細胞防止代謝應激和氧化損傷，對維持細胞內穩態以及細胞產物的合成、降解和循環再利用具有重要作用；但細胞自噬過度可能導致代謝應激、降解細胞成分，甚至引起細胞死亡等。研究表明，細胞自噬能在細胞穩態、衰老、免疫、腫瘤發生及神經退行性疾病等多種生理病理過程中發揮重要作用。
根據包裹物質及運送方式的不同可將細胞自噬分為3種類型（圖1）：

① 巨細胞自噬（macroautophagy）：通過形成具有雙層膜結構的細胞自噬體（autophagosome）包裹胞內物質，最終細胞自噬體與溶酶體融合。一般情況下所說的細胞自噬是指巨細胞自噬。

② 微細胞自噬（microautophagy）：通過溶酶體或液泡表面的形變直接吞沒特定的細胞器。

③ 分子伴侶介導的細胞自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）：具有KEFRQ樣基序的蛋白在HSP70伴侶的幫助下，通過LAMP-2A轉運體轉運到溶酶體。

 圖1. 3種細胞自噬途徑 (Duraes Fernanda V et al. Front Immunol, 2015)

2.細胞自噬的發生過程

細胞自噬是一種在進化上保守的細胞內分解代謝過程，在該過程中，細胞質大分子、聚集性蛋白、受損細胞器或病原體被運送至溶酶體，并被溶酶體水解酶降解，產生核苷酸、氨基酸、脂肪酸、糖和三磷酸腺苷，最終再循環到胞漿中。諸如饑餓、輻射、缺氧、細菌入侵、生長因子匱乏等多種因素均可誘導細胞自噬發生。
細胞自噬的發生過程大體分為以下4個階段（圖2）：
①細胞自噬的起始 在細胞自噬誘導信號的調控下，ULK1復合物和多種ATG蛋白被活化，并定位于前細胞自噬體處。
②隔離膜和細胞自噬體的形成  ATG蛋白和脂質不斷被募集，從而形成杯狀的雙層膜結構（隔離膜，phagophore）；隨著隔離膜的逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包裹，最終形成閉合的細胞自噬體（autophagosome）。
③細胞自噬體與溶酶體融合 細胞自噬體形成后將其包裹物通過胞內運輸系統運輸至溶酶體，并與溶酶體融合。
④細胞自噬體的裂解 細胞自噬體與溶酶體融合后形成細胞自噬溶酶體（autolysosome），最終在溶酶體水解酶的作用下降解其包裹物。
 總而言之，細胞自噬的本質其實是細胞內的膜重排。在膜重排的過程中，會形成一個具有雙層膜并裹挾著隨機或特定底物的封閉囊泡，即細胞自噬體，進而與溶酶體融合，形成細胞自噬溶酶體并降解底物。

 圖2. 細胞自噬的發生過程 （Li et al. Molecular Cancer，2020）

3.細胞自噬相關蛋白

細胞自噬的發生與營養狀態、能量狀態、氧化應激、缺血缺氧等相關，其受多重機制調節，如ULK1通路、Beclin1通路、AMPK通路等。在細胞自噬的發生過程中，有多種細胞自噬相關蛋白可調節和控制細胞自噬形成的不同階段。
如圖2所示，在細胞自噬的發生過程中，多種細胞自噬相關基因調控細胞自噬流的不同階段。迄今為止，科學家已在酵母中鑒定出40余個編碼ATG蛋白的基因，并且大多數在酵母和哺乳動物之間高度保守。在哺乳動物細胞中，饑餓誘導的細胞自噬大約受20種核心ATG基因調節，它們在液泡附近被不斷募集，并組裝形成細胞自噬前體。這些基因的分類和作用（表1）如下：
①ULK1激酶核心復合物 包括ULK1/2、ATG13、RB1CC1/FIP200和 ATG101；
②PI3K復合物 包括VPS34、VPS15、Beclin1和ATG14L；
③ATG9A轉運系統 包括ATG9A、WIPI1/2和ATG2A；
④ATG12泛素樣結合系統 包括ATG12、ATG7、ATG10、ATG5和ATG16L1；
⑤LC3泛素樣結合系統 包括LC3A/B/C、ATG7、ATG3和ATG4A/B/C/D。

表1. 細胞自噬相關基因及其在細胞自噬中的蛋白質功能
（Li et al. Molecular Cancer，2020）

4.細胞自噬的調控

細胞基礎水平的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，對細胞自噬研究多需人工干預。
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在細胞自噬反應中起著重要的調節作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，細胞自噬反應被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）被抑制后，細胞自噬反應機制啟動。細胞自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）通過形成Atg12-Atg5 和 LC3-II (Atg8-II)復合物來調控細胞自噬體的形成。
 細胞自噬既能抑制也能促進細胞凋亡，兩種反應在生物體內廣泛存在。在營養缺乏時，細胞自噬反應作為一個細胞的促活反應機制存在，但是過量的細胞自噬反應也會導致細胞死亡，但由細胞自噬導致的細胞死亡與細胞凋亡在形態學上有明顯的不同。幾種促凋亡信號因子，如TNF、TRAIL和 FADD也會誘導細胞自噬的反應發生。此外，Bcl-2也是細胞自噬反應重要的調節因子，其為凋亡抑制蛋白，通過與Beclin-1結合形成復合物，來抑制由Beclin-1誘導的細胞自噬。

已報道的部分干預藥物詳見表2：

表2. 細胞自噬激動劑和拮抗劑

 目前常用的細胞自噬激動劑有Rapamycin，EBSS等，常用的細胞自噬抑制劑有Chloroquine，3-MA，NH4Cl和 Bafilomycin A1等。這些細胞自噬激動劑和抑制劑可以分別激活/抑制細胞自噬發生的不同階段，因此研究者可以根據實驗需要選擇合適的激動劑或抑制劑。更多細胞自噬通路調控藥物見圖3。

圖3.細胞自噬通路調控藥物

（Lorenzo Galluzi et al. Nat Rev Drug Discov, 2017 ）

5.細胞自噬檢測方法

 在生理條件下，細胞自噬活性通常較低。但在饑餓、缺氧和疾病等刺激下細胞自噬活性會顯著上調。另外，細胞自噬抑制也與某些疾病相關，如癌癥、神經退行性疾病和傳染病等。鑒于細胞自噬與不同的生理和病理生理過程之間存在緊密聯系，故科學工作者需要選擇理想的細胞自噬檢測方法。細胞經細胞自噬誘導或抑制后，常用的觀察和檢測方法有∶

5.1 透射電鏡法

 細胞自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，直接在透射電鏡下觀察細胞自噬不同階段的形態變化是一種非常直接的方法。細胞自噬各階段的形態學特征見表3；透射電鏡下細胞自噬小體和細胞自噬溶酶體的形態見圖4。

表3. 細胞自噬各階段特征

圖4. 透射電鏡下細胞自噬小體（單箭頭）和細胞自噬溶酶體（雙箭頭）形態
（Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010）

5.2 熒光顯微鏡觀察法

LC3（light chain 3）全稱MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，貫穿整個細胞自噬過程，是目前公認的細胞自噬標記物。哺乳動物中的LC3與酵母中的細胞自噬相關蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。哺乳動物的LC3可分為三種：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B應用最為廣泛。
 LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產生細胞漿定位的LC3-I。在細胞自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）相偶聯，形成LC3-II并定位于細胞自噬體內外膜上。細胞自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產生LC3-I循環利用；內膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導致細胞自噬溶酶體中LC3含量很低（圖5）。因此，科研工作者可以通過熒光顯微鏡觀察內源性LC3或GFP-LC3，即可實現對細胞自噬發生的檢測。

圖5. LC3在細胞自噬發生中的路徑
 (Kiriyama, Y et al. International Electronic Conference on Medicinal Chemistry，2016)

GFP-LC3單熒光和mCherry-GFP-LC3雙熒光指示系統
 細胞自噬形成時，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白轉移至細胞自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色或黃色熒光斑點。當細胞自噬溶酶體形成后，酸性的溶酶體環境使GFP熒光淬滅，而mCherry熒光不受影響，細胞自噬溶酶體呈現紅色熒光（圖6）。因此，科研工作者可以通過LC3熒光指示系統來監測細胞自噬流。

圖6. LC3細胞自噬雙標系統追蹤細胞自噬流不同階段
（Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011）

5.3 Western Blot檢測LC3和p62蛋白的表達量

 ① 利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價細胞自噬形成（圖7）。細胞自噬形成時，胞漿型LC3-I會酶解掉一小段多肽，隨后跟PE結合轉變為膜型的LC3-II。因此可以通過LC3-II/I比值的大小估計細胞自噬水平的高低。

② 除LC3外，其他細胞自噬底物表達量的變化也可以用于監測細胞自噬流。其中，p62是研究廣泛的一個細胞自噬底物。p62（也稱為SQSTM1蛋白），由以下三個結構域組成：N端Phox和Bem1 (PB1)結構域、鋅指結構域和C端泛素相關(UBA)結構域。研究表明，p62蛋白鋅指結構域和UBA結構域之間的連接區域（LRS區域）負責與細胞自噬受體蛋白 Atg8/LC3結合，UBA結構域負責招募泛素化蛋白。在細胞自噬體形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進細胞自噬體，之后被細胞自噬溶酶體中的蛋白水解酶將其降解（圖8），所以p62蛋白的表達量與細胞自噬活性呈現負相關。因此，利用Western Blot檢測p62蛋白的表達量也可以用來評價細胞自噬水平（圖7）。

圖8. p62介導的選擇性細胞自噬模型
（Ichimura Y et al. J Biol Chem, 2008）

5.4 基于Keima蛋白的細胞自噬評價

 Keima是一種PH敏感型的熒光蛋白，其雙峰激發光譜依賴于周圍的pH值，在中性和酸性環境中分別在440 nm和586 nm處激活。Keima在中性和酸性pH中熒光信號不同的特性，可以直觀地反映細胞自噬程度。將細胞質的Keima傳遞到溶酶體可反映非選擇性細胞自噬，將Keima融合到特定的蛋白(如融合到線粒體靶向序列—mt-Keima，作為線粒體細胞自噬標記)可用于反映選擇性細胞自噬。值得注意是，基于keima的檢測不能在固定細胞中進行，因為這種檢測完全依賴于溶酶體的酸性。

6.維真細胞自噬相關產品

維真生物可提供細胞自噬研究相關工具，包含大量細胞自噬相關基因的現貨克隆，shRNA克隆，CRISPR克隆，以及LC3細胞自噬單雙標克隆和病毒，多種策略、多種規格、部分現貨，滿足您多樣化的研究需求。

6.1 病毒產品

細胞自噬單雙標病毒

注：啟動子為CMV

圖10. 維真細胞自噬雙標病毒載體圖譜

6.2 克隆產品

部分細胞自噬相關基因

附：維真細胞自噬雙標系統感染誘導細胞自噬的HEK293細胞效果圖

7.客戶代表性文章（部分）