鈣成像技術

神經元(yuan)的(de)活(huo)動是(shi)大腦(nao)復(fu)雜(za)行(xing)為表(biao)現的(de)基礎。而神經元(yuan)的(de)活(huo)動會引起細胞內(nei)(nei)游離(li)鈣濃度的(de)快速變化。鈣離(li)子(zi)作為一類重(zhong)要(yao)的(de)胞內(nei)(nei)信號分子(zi)，在神經元(yuan)功能中起著重(zhong)要(yao)的(de)作用，如突觸囊(nang)泡中神經遞(di)質的(de)釋放等。鈣成(cheng)像(xiang)技(ji)術可以直接測量神經元(yuan)和(he)神經元(yuan)組織中動態的(de)鈣流動，從(cong)而達到(dao)檢測神經元(yuan)活(huo)動的(de)目的(de)。

1、鈣成像原理：利用特(te)殊的(de)熒(ying)光(guang)染料或(huo)鈣離(li)子(zi)指示劑，將神經元(yuan)中鈣離(li)子(zi)濃度的(de)變化通過熒(ying)光(guang)強度表現出(chu)來，通過對鈣離(li)子(zi)變化的(de)快速成像(xiang)，反映(ying)神經元(yuan)的(de)活性變化。

2、鈣離子指示劑（Calcium Indicators）

對鈣(gai)離子(zi)的功能(neng)研究，鈣(gai)指示劑是必不可少的工(gong)具。根據(ju)熒光(guang)光(guang)譜、鈣(gai)離子(zi)親和(he)力及其(qi)化(hua)學(xue)特(te)性的不同(tong)大致(zhi)可分為化(hua)學(xue)指示劑和(he)遺傳編碼指示劑兩大類(lei)。

化學指示(shi)劑(ji)是檢測細胞質中(zhong)鈣離子(zi)濃(nong)度的傳統工(gong)具，主要(yao)是一(yi)些(xie)能(neng)特異性(xing)與鈣離子(zi)結合的小分子(zi)，包(bao)括Fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1等，這(zhe)些(xie)小分子(zi)都(dou)是被稱作BAPTA的鈣離子(zi)螯合劑，是乙二醇雙四乙酸(suan)（EGTA）的一(yi)種同系(xi)物，對Ca2+具有較高的選擇性(xing)。化學熒光(guang)指示劑通(tong)常采用電極刺穿或(huo)借助(zhu)乙酰(xian)氧基甲酯和右旋(xuan)葡萄糖的方式進入到目標部位。

遺傳(chuan)編碼鈣離子指示劑（genetically encoded calcium indicators，GECIs），是隨著基(ji)因工程技術的發展，出(chu)現的一(yi)種(zhong)新型的鈣離(li)(li)子(zi)指示(shi)劑，它(ta)可(ke)以實(shi)現在體實(shi)驗中對鈣離(li)(li)子(zi)的長時程檢測和(he)實(shi)時動態檢測，并且(qie)還可(ke)以借助細(xi)胞器的特異性(xing)定位信號(hao)表征某些特定的亞細(xi)胞結構的鈣離(li)(li)子(zi)變化情況(kuang)。

根據發光(guang)原理可將GECIs分為兩(liang)大類，以單個(ge)熒(ying)(ying)光(guang)蛋白為基(ji)礎的(de)GECIs和由熒(ying)(ying)光(guang)共(gong)振能(neng)量轉移（FRET）的(de)熒(ying)(ying)光(guang)蛋白對構成的(de)GECIs。前者(zhe)主要包括(kuo)Pericams、GCaMP和Camgaroos，后者(zhe)主要包括(kuo)TN-XXL、Cameleons、D3cpV等。GECIs類鈣指示(shi)劑則主要借助于(yu)病毒感染(ran)的(de)方式(shi)導入至(zhi)目標部(bu)位。

遺傳編碼鈣離子指示劑
（Jihae Oh et al. Korean J Physiol Pharmacol. 2019）

3、GCaMPs鈣指示(shi)劑

在GECIs中，以結(jie)構(gou)導向(xiang)設(she)計的GCaMP應用最為廣泛。GCaMPs是單(dan)個(ge)綠色熒光蛋(dan)(dan)白GFP、鈣調蛋(dan)(dan)白CaM和平滑肌細(xi)胞肌球蛋(dan)(dan)白輕鏈激(ji)酶片段(duan)M13融合(he)的產物。在Ca2+存在的情(qing)況下，CaM會和M13結(jie)合(he)，大大增加熒光的強度。其結(jie)構(gou)示意圖(tu)和成像原理如下圖(tu)所示。

4、鈣成像研(yan)究步驟(zou)

下面以遺傳編碼類鈣離子指示劑為例，簡述研究步驟：
第一步：選取合適的GECIs類鈣離子指示劑；
第二步：通過病毒感染的方式將鈣離子指示劑導入目標位置；
第三步：記錄鈣離子的動(dong)態變(bian)化，分(fen)析神經元活動(dong)。

5、如(ru)何選擇合適的鈣指(zhi)示劑(以(yi)GCaMPs為例(li))

自(zi)2001年GCaMP1問世以來(lai)，科學家們通過基于(yu)(yu)結構的(de)(de)(de)(de)(de)突變和(he)基于(yu)(yu)神經(jing)(jing)元(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)篩選(xuan)(xuan)方法不(bu)斷優(you)化(hua)GCaMP的(de)(de)(de)(de)(de)親和(he)性(xing)、信噪比(bi)、動(dong)力(li)學和(he)動(dong)態范圍等，先后(hou)成(cheng)功(gong)開發過GCaMP2,GCaMP3,GCaMP5、GCaMP6和(he)jGCaMP7，以滿足研究者不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)像(xiang)(xiang)實(shi)驗。那么(me)，面對眾多的(de)(de)(de)(de)(de)GCaMPs鈣指(zhi)示劑，我(wo)們該如何選(xuan)(xuan)擇呢(ni)？眾所(suo)周(zhou)知，不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)像(xiang)(xiang)實(shi)驗需要(yao)(yao)使用(yong)不(bu)同(tong)性(xing)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)GCaMP，如本底熒光(guang)(guang)低的(de)(de)(de)(de)(de)GCaMP適用(yong)于(yu)(yu)寬視場成(cheng)像(xiang)(xiang)技術，可以同(tong)時(shi)檢(jian)測(ce)大量(liang)神經(jing)(jing)元(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)活動(dong)，這(zhe)主(zhu)要(yao)(yao)是由于(yu)(yu)大量(liang)神經(jing)(jing)元(yuan)被GCaMP標記，光(guang)(guang)子數多，容(rong)易形成(cheng)比(bi)較強的(de)(de)(de)(de)(de)背景(jing)熒光(guang)(guang)；本底熒光(guang)(guang)高的(de)(de)(de)(de)(de)適用(yong)于(yu)(yu)檢(jian)測(ce)神經(jing)(jing)亞細胞的(de)(de)(de)(de)(de)信號(hao)，如樹(shu)突棘和(he)軸突，這(zhe)主(zhu)要(yao)(yao)是由于(yu)(yu)這(zhe)些神經(jing)(jing)亞細胞結構體積小(xiao)，GCaMP表達少，光(guang)(guang)子數少，背景(jing)熒光(guang)(guang)低甚至可以被忽(hu)略；快動(dong)力(li)學的(de)(de)(de)(de)(de)GCaMP適合(he)檢(jian)測(ce)神經(jing)(jing)元(yuan)放(fang)電模式的(de)(de)(de)(de)(de)動(dong)態變化(hua)；慢動(dong)力(li)學的(de)(de)(de)(de)(de)GCaMP則適合(he)檢(jian)測(ce)所(suo)有活動(dong)的(de)(de)(de)(de)(de)神經(jing)(jing)元(yuan)。下表是GCaMP6和(he)jGCaMP7系列探(tan)針(zhen)的(de)(de)(de)(de)(de)特點：

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8、參考文獻：

1. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors；
2. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity；
3. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.