欧美日韩亚洲视频在线,精品视频在线观看免费播放,精品一区二区三区欧美人妖,国产精品福利片免费看,嫩草在线视频WWW免费看,在线精品国内视频秒播,国产痴汉一区二区三区在线观看,青青草成人免费在线

一、載體分類及載體組成元件

載體分類

1、按(an)屬性分類：病毒載體(ti)(ti)和非(fei)病毒載體(ti)(ti)

病(bing)(bing)毒(du)載(zai)體是一種(zhong)常見(jian)的(de)分(fen)子生物(wu)學工具(ju)，可將(jiang)遺(yi)傳(chuan)物(wu)質帶入細胞(bao)，原理是利用病(bing)(bing)毒(du)具(ju)有傳(chuan)送其基(ji)(ji)因組進(jin)入目的(de)細胞(bao)，進(jin)行感染的(de)分(fen)子機制。可發生于完整(zheng)活體或是細胞(bao)培(pei)養中(zhong)。可應(ying)(ying)用于基(ji)(ji)礎(chu)研究、基(ji)(ji)因療(liao)法或疫(yi)苗。用于基(ji)(ji)因治療(liao)和疫(yi)苗的(de)病(bing)(bing)毒(du)載(zai)體應(ying)(ying)具(ju)備以下基(ji)(ji)本(ben)條件：

（1）攜(xie)帶(dai)外(wai)源基因(yin)并能包裝成(cheng)病毒顆粒；

（2）介導外源(yuan)基因的轉(zhuan)移和表(biao)達(da)；

（3）對(dui)人體(ti)不(bu)致病；

（4）在環境中不會引起增殖和傳播。

非病毒(du)載體一般是指質粒DNA。

2、按進入受(shou)體細胞(bao)的類型分類：原核載(zai)體、真核載(zai)體、穿梭(suo)載(zai)體（含原核和真核2個復制子，能在原核和真(zhen)核細胞(bao)中復制，并可以在真(zhen)核細胞(bao)中有(you)效表達）。

3、按功能分類(lei)：克隆(long)載體、表達載體

克隆載(zai)體：具有克隆載(zai)體的基(ji)本元件（Ori，Ampr，MCS等），可(ke)以(yi)攜(xie)帶DNA片段(duan)或(huo)外(wai)源基因進(jin)入受(shou)體(ti)細(xi)胞(bao)并克隆和大量擴增DNA片段（外源基因）的載體(ti)。

表達(da)載體：克隆載體中加入一些(xie)與表達(da)調控（具有轉錄/翻(fan)譯所必需的DNA順序）有關的元件即成(cheng)為表達(da)載(zai)體(ti)。

載體組成元件

1、復制起(qi)始位點Ori：即控(kong)制復(fu)制起(qi)始的位點。Ori的箭頭指(zhi)(zhi)復制方(fang)(fang)向(xiang)，其他(ta)元(yuan)件標(biao)注(zhu)的箭頭多指(zhi)(zhi)轉錄方(fang)(fang)向(xiang)（正向(xiang)）。

2、抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ，Kan+

（1）Ampr：水解β-內酰胺環，解除氨芐的(de)毒性。

（2）tetr ：可以阻止四環素(su)進(jin)入細(xi)胞。

（3）camr：生成氯霉素羥(qian)乙酰基衍(yan)生物，使之失去(qu)毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuan)移(yi)酶，使G418（卡(ka)那霉素衍生物）失(shi)活(huo)。

（5）hygr：使潮霉(mei)素β失活。

3、多克隆位點：MCS克隆攜帶外源(yuan)基(ji)(ji)因(yin)片段(duan)，它具有多個限制酶的(de)(de)(de)(de)單一切點(dian)，便于外源(yuan)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)插入(ru)。如果在(zai)這些位點(dian)外有外源(yuan)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)插入(ru)，會導(dao)致某種標志基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)失活，便于篩選。決定能不能放(fang)目(mu)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)以及如何放(fang)置目(mu)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)。還要再看(kan)外源(yuan)DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10kb的(de)外源DNA片段(duan)。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低(di)。

4、P/E：啟動子(zi)/增(zeng)強子

5、Terms：終止信號

6、加poly（A）信號：可以起到穩定mRNA作用(yong)

示例閱讀載體：

pENTER載體

1）human ORF + pENTER載體

2） CMV啟(qi)動子，T7啟(qi)動子(zi)

3） ORF的C端融合了Flag和His tag

4) 多克隆位點，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常見的)

4） SV40 poly（A）加尾信號

5） SV40啟動(dong)子啟動(dong)的(de)puro標記

6） 2個腺病毒ITR序列(lie)和(he)2個(ge)與(yu)腺(xian)病毒(du)Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組(zu)到腺(xian)病(bing)毒(du)載(zai)體，直接(jie)用于(yu)腺(xian)病(bing)毒(du)的生產。

慢病毒載體

1）EF1a啟動目的(de)基因(yin)（可添加小標簽FLAG或HIS等小(xiao)標簽）

2）CMV啟(qi)動(dong)GFP，非(fei)融合抗性篩(shai)選標(biao)記Puro（便于做(zuo)細胞株的穩篩）

3）WPRE（來自(zi)土撥(bo)鼠肝炎病毒(du)的轉(zhuan)錄后調節元件），放(fang)置在目的基因的上游，能加(jia)強轉(zhuan)基因的表(biao)達

4)  cPPT（來自HIV-1整合酶基因(yin)），增加慢病毒在(zai)宿主基因(yin)組的拷貝(bei)數，提高病毒滴度(du)

5）第三代慢病毒載(zai)體，載(zai)體中還包(bao)含HIV-1基因組中的順(shun)式調(diao)節元件(ψ 包裝 信號和LTR 長末(mo)端重復序列，其中3’LTR增強子功能缺失，5’LTR中(zhong)U3區替(ti)代為(wei)CMV，更加安(an)全的病毒載體(ti))

腺相關病毒載體(ti)

AAV表達載體包(bao)括了中兩(liang)個ITR + CMV（可替換其他(ta)組織特異(yi)性啟動(dong)子，見改造載(zai)體部分）+ globin intron 內含子序列 + 目的基因 + poly A序(xu)列

二、選擇(ze)和準(zhun)備載體

選擇載(zai)體(ti)主(zhu)要(yao)依據(ju)構建的(de)(de)目(mu)的(de)(de)，同時還(huan)要(yao)考慮載(zai)體(ti)中應有合適的(de)(de)限(xian)制酶切(qie)位點(dian)等。如果構建的(de)(de)目(mu)的(de)(de)是要(yao)表(biao)達一(yi)個特(te)定(ding)的(de)(de)基因，則要(yao)選擇合適的(de)(de)表(biao)達載(zai)體(ti)。選用(yong)哪種載(zai)體(ti)，還(huan)是要(yao)結合目(mu)的(de)(de)基因及載(zai)體(ti)特(te)點(dian)以實驗目(mu)的(de)(de)為準繩。

載體選擇(ze)主要考慮(lv)下述3點：

1、構建DNA重(zhong)組體的目(mu)的，克隆擴增/表達(da)表達(da)，選擇合適的克(ke)隆(long)載體/表達載(zai)體。

2、載(zai)體的類型：

（1）克隆載體(ti)的克隆能力(li)—據克隆片段大小（大選(xuan)大，小選(xuan)小）。尤其對于病毒(du)載體(ti)來說，載體(ti)包裝(zhuang)容量的大小是(shi)評估能否成功(gong)包裝(zhuang)病毒(du)的首要因素(su)。

①腺病毒可以插入(ru)長約8kb的(de)外源(yuan)基(ji)因(yin)。目(mu)前，我們包裝過長度(du)為7.5kb外源基因的(de)腺病毒。

②慢病毒的包裝容量約為6kb（包含載體帶有(you)的其他抗性基(ji)因或報告基(ji)因），但是2kb以上的外源基因包裝慢病(bing)毒難度就增加了，增大(da)1kb會下降1個單位數量級(ji)的滴度，故2kb以(yi)上(shang)的基(ji)因包裝慢病毒需(xu)要(yao)進行評(ping)估。此外，毒性(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)、凋亡(wang)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)和膜蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)（作(zuo)為受體、轉運蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)行使功能）等(deng)由于其本身的功能，包裝可能會(hui)有(you)一(yi)定難度。

③AAV的總包(bao)裝(zhuang)容量是4.7 kb（包(bao)含載體中兩個ITR約(yue)0.3kb +具體啟動子 + 內含子約0.6kb + 具體熒光標簽 + polyA約0.2kb），所以插入目的基因一(yi)般約2kb 左右(you)。由于AAV包裝容量有限，目的基(ji)因大于2kb，可考慮去除內(nei)含子，因為(wei)內(nei)含子只(zhi)是(shi)有助于插入的目的基因穩(wen)定表達。

（2）確(que)定(ding)表(biao)達蛋(dan)白的(de)目(mu)的(de)，然(ran)后再(zai)來選擇優勢的(de)表(biao)達質(zhi)粒。一般分為(wei)原核表(biao)達和真核表(biao)達質(zhi)粒，前者(zhe)主要用于體外純化(hua)蛋(dan)白，如(ru)帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不(bu)同的(de)表達載體(ti)，就得(de)建立相應(ying)的(de)純化系統，包括緩沖液的(de)配置、珠子/柱子的選擇(ze)等(deng)等(deng)，還得考慮目的蛋(dan)白的可溶性(xing)，一般大(da)tag的融合蛋白可溶性要好(hao)一些，如(ru)GST的(de)(de)。這種原核(he)純化的(de)(de)蛋白(bai)一(yi)般用來(lai)制備單一(yi)的(de)(de)、需要量大的(de)(de)蛋白(bai)。真核(he)表(biao)達(da)載(zai)體一(yi)般是(shi)細(xi)胞、體內表(biao)達(da)等(deng)需要時所(suo)用，只(zhi)需要將它(ta)放(fang)到細(xi)胞或體內細(xi)胞即可，唯(wei)一(yi)考慮(lv)的(de)(de)是(shi)它(ta)的(de)(de)啟(qi)動子的(de)(de)選擇，常用都是(shi)cmv啟(qi)動子(zi)(zi)的(de)，表(biao)達(da)(da)(da)效(xiao)率較高，也有(you)多種啟(qi)動子(zi)(zi)經過改造的(de)表(biao)達(da)(da)(da)載體，一般用來表(biao)達(da)(da)(da)需要調控表(biao)達(da)(da)(da)時間及表(biao)達(da)(da)(da)量的(de)蛋(dan)白。

①選分子量小的質粒，即(ji)小載體（1-1.5kb）→不易(yi)損(sun)壞，在細菌里面(mian)拷貝數也多（也有大載體）；

②一(yi)般使用松弛型質粒在細(xi)菌里擴增不(bu)受約(yue)束(shu)，一(yi)般10個以上的拷貝，而嚴謹(jin)型(xing)質(zhi)粒<10個；

③必(bi)需(xu)具(ju)備一個(ge)以上的酶(mei)切位點，有(you)選擇的余地；

④必需有易(yi)檢測的(de)標記，多是抗(kang)生素的(de)抗(kang)性(xing)基因(yin)。

①對于無起始密(mi)碼子(zi)(zi)和終止密(mi)碼子(zi)(zi)的(de)基因，插入無標(biao)簽的(de)載體要(yao)加入起始密(mi)碼子(zi)(zi)和終止密(mi)碼子(zi)(zi)。

②載體N端有標簽，上游(you)引物要(yao)對讀碼框；下(xia)游(you)引物要(yao)加終止密碼子(為了保證基因(yin)的(de)表達,少翻譯載體序列(lie)) 。

鏈(lian)接(jie)：對讀碼(ma)框是(shi)為了(le)防止移碼(ma)，是(shi)不是(shi)移碼(ma)要看(kan)載體圖譜，看(kan)酶切(qie)位點。從ATG開(kai)始(shi)，要保證三個(ge)堿基(ji)編碼(ma)的(de)氨基(ji)酸不能(neng)影響插入(ru)目的(de)基(ji)因的(de)正(zheng)(zheng)常編碼(ma)，若(ruo)影響了插入(ru)目的(de)基(ji)因的(de)正(zheng)(zheng)常編碼(ma)就(jiu)要在設(she)計引物的(de)時候(hou)在酶切位(wei)點(dian)前(qian)或者(zhe)后(hou)插入(ru)一個(ge)或者(zhe)兩個(ge)堿基(ji)，總之是不能(neng)影響插入(ru)目的(de)基(ji)因的(de)正(zheng)(zheng)常編碼(ma)蛋白。有的(de)酶切位(wei)點(dian)含有起始(shi)密碼(ma)子，如(ru)果標簽在C端像Nco I就有一個ATG，這時候(hou)需要(yao)加堿基在酶(mei)切位點(dian)后面。

③載體C端有標(biao)簽，上游(you)引物要加起(qi)始密(mi)碼子，且(qie)考慮是(shi)否加Kozak序列（真核表達系統）；下游引物要(yao)對(dui)讀碼框，并且要(yao)去掉基因本身(shen)的終(zhong)止密碼子（保(bao)證C端標(biao)簽表達(da)）。

鏈接：Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽(mao)子結構后(hou)面的一段核(he)酸序(xu)列，通常是GCCGCCRCC（常見的序列是GCCACC），位于起始密碼子（ATG）之前(qian)。它可以與翻譯起始(shi)因子結(jie)合(he)而介導含有5’帽子(zi)結構的(de)mRNA翻譯起(qi)始(shi)。在(zai)真核生物中，該序列相對(dui)比較保守(shou)。對(dui)應于(yu)原核生物的SD序列(lie)（原核(he)基(ji)因在mRNA5’端起始密碼子AUG上游(you)一段對mRNA的(de)翻譯(yi)起作用的(de)序列）。

添(tian)加Kozak序(xu)列的好處(chu)：核糖體需(xu)要Kozak序列(lie)進行穩定(ding)結合有助(zhu)于提高真(zhen)核基因(yin)的轉錄和翻譯的效率。

三、改(gai)造載體(ti)

1、改造啟動子：一般在過表達載體中CMV屬于廣譜型的強啟(qi)動子，具體(ti)可根據實驗需求，選用不同啟(qi)動子，尤其是對于AAV載(zai)體構建時(shi)選用組織特異性啟動子。

2、實驗目的的需要：

①構建(jian)過表達or干擾(rao)載體

根據實(shi)驗用途(tu)選擇(ze)載體，如過表達載體通常選用CMV啟動子(zi)，CMV因(yin)其集(ji)中了(le)細胞轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子結合位點而具(ju)有(you)異(yi)常高的(de)活(huo)性，是公(gong)認的(de)真核表達中的(de)增強子，一般(ban)插入(ru)某個(ge)基因(yin)的(de)CDS區到CMV啟動子下游，CMV負責啟動該(gai)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達，從而達到調(diao)高該(gai)基(ji)因(yin)表(biao)達的(de)作用；而U6和(he)H1更(geng)多的是(shi)用(yong)于shRNA的啟動(dong)來達(da)到敲(qiao)低一個(ge)基因的作用，U6和H1啟動子都是RNA聚合(he)酶Ⅲ依賴的啟動(dong)子(zi)，其特(te)點是啟動(dong)子(zi)自(zi)身元素均位于轉錄區(qu)的上游，適合(he)于表達約21個核苷酸和(he)約50個核苷酸莖環結構（stem loop），RNA聚合酶Ⅲ有(you)明確的起始和終止序列，當RNA聚合酶Ⅲ到連續4個(ge)或5個T時(shi)，它指導(dao)的轉錄就會停止(zhi)。

我們公司(si)的shRNA病(bing)毒(du)載體（包括腺病(bing)毒(du)載體、慢病(bing)毒(du)載體和腺相關病(bing)毒(du)載體）是由U6或H1 啟(qi)動shRNA 實現，并連接了報告(gao)基因，可(ke)以實時監測載體(ti)的(de)轉染(ran)效率。構(gou)建干擾載體(ti)針對目的(de)基因（目的(de)基因需要大于0.7kb，若小于0.7kb需要評估來確保(bao)能設計出8條(tiao)shRNA序列），設(she)計(ji)并提供4個針對靶(ba)基因的shRNA產品，確保4個shRNA中的(de)1個(ge)產品在細胞感染(ran)效率達80%以上(shang)的前提下，在mRNA水平至少有70%的沉默效(xiao)果(guo)；也可以按照客(ke)戶的要求來設計，由客(ke)戶確定shRNA 序列的長度(du)，對于每條選定的靶序列，設(she)計正義鏈和(he)反義鏈，以 loop莖(jing)環結(jie)構(gou)相連，合成(cheng)shRNA。

②是否攜帶GFP等(deng)熒光(guang)標簽

攜(xie)帶熒光(guang)(guang)標(biao)(biao)簽基本(ben)目(mu)的是為了觀察感染目(mu)的細胞(bao)的效率；攜(xie)帶該標(biao)(biao)簽的好處之一(yi)是不(bu)用破碎(sui)組(zu)織細胞(bao)和不(bu)加任(ren)何(he)底物，直接通過熒光(guang)(guang)顯微鏡(jing)就(jiu)能在活細胞(bao)中發出綠色熒光(guang)(guang)，實時顯示目(mu)的基因的表達(da)及定位(wei)情況，而且熒光(guang)(guang)性(xing)質穩定。但(dan)是，由于GFP標簽比較大（約720bp），這種大標簽在位置上對目的(de)基(ji)因造成(cheng)了空(kong)(kong)間位阻作用，對蛋(dan)白的(de)空(kong)(kong)間結構(gou)產生一定影響，從而不利于目的(de)基(ji)因蛋(dan)白本身的(de)活性及正常(chang)功能的(de)發揮。此外，還需要結合(he)蛋(dan)白本身的(de)特性，比(bi)如該蛋(dan)白為具有切(qie)割活性的(de)蛋(dan)白，即使融合(he)了GFP，標簽很有可(ke)能(neng)會被破壞，終(zhong)究會影響GFP的(de)熒光及基本功(gong)能。一般不(bu)建(jian)(jian)議(yi)融合(he)這么大的(de)標簽(qian)，實驗需要帶熒光標簽(qian)，建(jian)(jian)議(yi)構建(jian)(jian)載體時通過(guo)P2A非融合。

③是否融合6×His、HA、Myc、FLAG等(deng)小標簽

為了做免疫共沉淀實驗或(huo)者WB檢測(ce)蛋白表達,需要(yao)加(jia)融(rong)合小標簽。多數情(qing)況下,由于多肽標(biao)簽相(xiang)對(dui)較小(xiao)(xiao)，對(dui)目的蛋白質結構(gou)影(ying)響小(xiao)(xiao)。但是在蛋白合成(cheng)(cheng)肽鏈的過程中，如果(guo)影(ying)響了(le)蛋白的折疊，也會造成(cheng)(cheng)目的蛋白活性的下降甚(shen)至功能的喪失。

④是否含有表達(da)系統元件，即(ji)啟動子－核糖(tang)體(ti)結(jie)合位點－克隆(long)位點－轉錄終止信號。

鏈(lian)接：啟動子：促進DNA轉錄(lu)的DNA序列，這個DNA區域常在(zai)基因或操(cao)縱子編(bian)碼區的(de)上游，是(shi)DNA分子(zi)上可(ke)以與RNA聚(ju)合酶(mei)特異性結合并使之開始(shi)轉(zhuan)錄的(de)部位，但(dan)啟(qi)動子(zi)本身不被轉(zhuan)錄。

增強(qiang)子(zi)：為真核(he)基(ji)因組（包(bao)括真核(he)病毒基(ji)因組）中的一種具有增強(qiang)鄰近基(ji)因轉錄過程的調控順序，其作用(yong)與其所(suo)在的位置或(huo)方(fang)向無關(guan)。即(ji)在所(suo)調控基(ji)因上游或(huo)下游均可發揮(hui)作用(yong)。

沉默子(zi)：負增強(qiang)子(zi)，負調控序(xu)列。

起作用的序列。

轉錄終止順(shun)序（終止子）/翻譯終(zhong)止密碼子(zi)：結構基(ji)因的最(zui)后一個(ge)外(wai)顯子(zi)中有一個(ge)AATAAA的(de)保守(shou)序列，此位點下游有一(yi)段GT或(huo)T富(fu)豐(feng)區，這2部分共同構(gou)成poly（A）加(jia)尾信號。

3、載體中P2A和IRES的選擇：

四、影響載體選擇的因素：

? 原核表達 or 真核(he)表(biao)達

? 細胞實驗 （過(guo)表達 or 干(gan)擾、瞬時表(biao)達 or穩轉株(zhu)、基(ji)因大(da)小、熒光(guang)、藥篩(shai) ）

?動物實驗 （過表達 or 干擾、注(zhu)射部位(wei)、基因大小、觀察(cha)周期 ）