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一、載體(ti)分(fen)類(lei)及載體(ti)組成元件

載體分類

1、按屬性分(fen)類：病毒載體和(he)非病毒載體

病(bing)毒載體是一(yi)種常見的(de)(de)分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學工具，可將遺傳(chuan)物(wu)質(zhi)帶入細胞，原理(li)是利用(yong)病(bing)毒具有傳(chuan)送其基因組進入目的(de)(de)細胞，進行感(gan)染的(de)(de)分(fen)子(zi)機制(zhi)。可發生(sheng)于(yu)完整活體或(huo)是細胞培(pei)養中(zhong)。可應用(yong)于(yu)基礎研究、基因療法或(huo)疫(yi)苗。用(yong)于(yu)基因治療和疫(yi)苗的(de)(de)病(bing)毒載體應具備(bei)以下基本條件：

（1）攜(xie)帶外源基因并能包裝成病(bing)毒顆粒；

（2）介(jie)導外源基因的轉(zhuan)移和表達；

（3）對人體不致病(bing)；

（4）在環(huan)境中不會引(yin)起增(zeng)殖和傳播。

非病毒(du)載體(ti)一般是指質粒(li)DNA。

2、按進入受體細胞的類(lei)(lei)型分(fen)類(lei)(lei)：原(yuan)核(he)載體、真(zhen)核(he)載體、穿梭載體（含(han)原(yuan)核(he)和(he)真(zhen)核(he)2個(ge)復制(zhi)子，能(neng)在(zai)原核(he)和真(zhen)核(he)細(xi)(xi)胞中(zhong)復制(zhi)，并可以在(zai)真(zhen)核(he)細(xi)(xi)胞中(zhong)有效表達）。

3、按功能(neng)分類：克隆(long)載體、表達載體

克(ke)隆(long)載體(ti)：具有克(ke)隆(long)載體(ti)的(de)基本元(yuan)件(jian)（Ori，Ampr，MCS等），可以(yi)攜帶(dai)DNA片(pian)段(duan)或外源(yuan)基因(yin)進入(ru)受體細胞(bao)并(bing)克隆和大量擴增DNA片段(duan)（外源(yuan)基因）的載體。

表達載體：克隆載體中加入一些(xie)與(yu)表達調控（具(ju)有(you)轉錄(lu)/翻譯所必需的DNA順(shun)序）有關的元件即成(cheng)為表(biao)達載體。

載體(ti)組成(cheng)元件

1、復制(zhi)起始位點Ori：即控制復制起始(shi)的位點。Ori的箭(jian)頭指復制方向，其他(ta)元件標注的箭(jian)頭多指轉錄方向（正向）。

2、抗生素抗性基因：可以(yi)便于加以(yi)檢測，如Amp+ ，Kan+

（1）Ampr：水解(jie)β-內酰胺環，解除氨芐(xia)的(de)毒性(xing)。

（2）tetr ：可以阻(zu)止四環素進入細胞。

（3）camr：生成氯霉素(su)羥(qian)乙酰基衍生物(wu)，使之失去(qu)毒性。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉移酶(mei)，使G418（卡那(nei)霉素衍生(sheng)物）失活。

（5）hygr：使潮霉素β失活。

3、多克(ke)隆位點(dian)：MCS克隆攜帶外(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因(yin)片(pian)段，它具(ju)有多個限制酶(mei)的(de)單一(yi)切(qie)點(dian)，便于外(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因(yin)的(de)插入(ru)。如果在這些位(wei)點(dian)外(wai)有外(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)因(yin)的(de)插入(ru)，會導致(zhi)某種(zhong)標(biao)志基(ji)因(yin)的(de)失活，便于篩選。決(jue)定能不能放(fang)目的(de)基(ji)因(yin)以及如何放(fang)置目的(de)基(ji)因(yin)。還(huan)要(yao)再看外(wai)源(yuan)(yuan)DNA插入(ru)片(pian)段大(da)小。質(zhi)粒一般只能容納(na)小于(yu)10kb的外(wai)源DNA片段。一(yi)般(ban)來說，外源DNA片(pian)段(duan)越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低(di)。

4、P/E：啟動子/增強子

5、Terms：終(zhong)止信號

6、加(jia)poly（A）信號(hao)：可(ke)以起到穩定(ding)mRNA作用

示例閱讀載體：

pENTER載體

1）human ORF + pENTER載體

2） CMV啟動子，T7啟(qi)動子

3） ORF的C端融合了Flag和His tag

4) 多克(ke)隆(long)位點，常(chang)用AsisI 和 MluI(人(ren)源基因上不常(chang)見的)

4） SV40 poly（A）加尾信(xin)號

5） SV40啟(qi)動子啟(qi)動的puro標記(ji)

6） 2個腺病毒ITR序(xu)列和(he)2個與腺(xian)病毒Ad5同源的序(xu)列(lie)，可用于將ORF序(xu)列同源重組(zu)到腺病毒(du)載體，直接用于腺病毒(du)的生產(chan)。

慢(man)病毒載體

1）EF1a啟動目的基因（可添加小(xiao)標簽FLAG或HIS等小(xiao)標簽）

2）CMV啟動GFP，非融合(he)抗性(xing)篩(shai)選標記Puro（便于做細胞(bao)株的穩篩）

3）WPRE（來自土撥鼠肝炎(yan)病(bing)毒的(de)轉(zhuan)錄后調節元(yuan)件），放置在目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)上游，能加(jia)強(qiang)轉(zhuan)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達

4)  cPPT（來(lai)自(zi)HIV-1整合(he)酶基(ji)因(yin)），增加慢(man)病(bing)毒在宿主基(ji)因(yin)組(zu)的(de)拷貝數，提高病(bing)毒滴度(du)

5）第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1基(ji)因組中的順(shun)式調節(jie)元件(ψ 包裝 信號和LTR 長末端重復序列，其中(zhong)3’LTR增強子功能缺失，5’LTR中(zhong)U3區替代為(wei)CMV，更加安全的病毒載體(ti))

腺(xian)相關病毒載體

AAV表達載體包括了中兩個(ge)ITR + CMV（可替換其他組織特異性啟動子，見改造(zao)載體部分）+ globin intron 內含子序列(lie) + 目的基因 + poly A序列

二、選擇和準備(bei)載(zai)體

選(xuan)擇(ze)載(zai)體(ti)主要(yao)依據(ju)構建的(de)目(mu)的(de)，同時還(huan)要(yao)考慮載(zai)體(ti)中(zhong)應有合適的(de)限制酶切位(wei)點等。如(ru)果構建的(de)目(mu)的(de)是(shi)要(yao)表(biao)達一個特定的(de)基因，則要(yao)選(xuan)擇(ze)合適的(de)表(biao)達載(zai)體(ti)。選(xuan)用哪種(zhong)載(zai)體(ti)，還(huan)是(shi)要(yao)結(jie)合目(mu)的(de)基因及載(zai)體(ti)特點以實驗目(mu)的(de)為(wei)準繩。

載(zai)體選擇(ze)主要考(kao)慮下述3點：

1、構(gou)建DNA重組體(ti)的目的，克隆擴增/表達(da)表達(da)，選擇合(he)適的(de)克隆載體(ti)/表達載體。

2、載體的(de)類型：

（1）克(ke)隆載(zai)(zai)體(ti)(ti)的(de)(de)克(ke)隆能力(li)—據克(ke)隆片段大小（大選大，小選小）。尤其對(dui)于病(bing)毒(du)(du)載(zai)(zai)體(ti)(ti)來說，載(zai)(zai)體(ti)(ti)包(bao)裝容量(liang)的(de)(de)大小是評估能否(fou)成功包(bao)裝病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)首要因素。

①腺病(bing)毒可以插入(ru)長約8kb的外源(yuan)基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基(ji)因的腺(xian)病毒。

②慢病(bing)毒(du)的包裝容量約為(wei)6kb（包含載體帶(dai)有(you)的其(qi)他抗性基因或報告基因），但是2kb以上(shang)的外源基因包裝慢病毒難(nan)度就增加(jia)了，增大1kb會下降1個(ge)單位(wei)數量級的(de)滴(di)度，故2kb以上的基因(yin)包裝(zhuang)慢病毒需要進行(xing)評(ping)估(gu)。此外，毒性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)、凋(diao)亡蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)和(he)膜蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)（作為受體、轉運蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)行(xing)使功能(neng)）等由(you)于其本身的功能(neng)，包裝(zhuang)可能(neng)會(hui)有一定(ding)難度。

③AAV的總包裝(zhuang)容(rong)量是(shi)4.7 kb（包含載體中兩(liang)個(ge)ITR約(yue)0.3kb +具體(ti)啟(qi)動子 + 內含子約0.6kb + 具體熒光標簽 + polyA約(yue)0.2kb），所以插入目的基(ji)因一般約(yue)2kb 左右。由于AAV包裝(zhuang)容量有限(xian)，目的基因大于2kb，可考(kao)慮去(qu)除內(nei)含子，因為(wei)內(nei)含子只(zhi)是有助于插入(ru)的(de)目的(de)基因穩定表達。

（2）確定表(biao)(biao)達蛋白的(de)目的(de)，然后再來選擇優勢的(de)表(biao)(biao)達質粒。一般分為原核表(biao)(biao)達和(he)真(zhen)核表(biao)(biao)達質粒，前者主要用于體(ti)外純化蛋白，如(ru)帶His-tag的PET系列，帶(dai)GST-Tag的PGEX系(xi)列，選(xuan)用不同的表(biao)達載體(ti)，就得建立相應(ying)的純(chun)化系(xi)統，包括緩沖液的配置、珠(zhu)子/柱子的(de)選(xuan)擇等等，還得考慮目的(de)蛋(dan)白的(de)可溶性，一般(ban)大tag的融合蛋白可(ke)溶性要好一些，如GST的(de)(de)。這(zhe)種原核純化的(de)(de)蛋白(bai)一般用(yong)來制備單一的(de)(de)、需要(yao)量大的(de)(de)蛋白(bai)。真(zhen)核表達載體一般是細胞、體內(nei)表達等需要(yao)時所(suo)用(yong)，只需要(yao)將它(ta)放到(dao)細胞或體內(nei)細胞即可，唯一考慮的(de)(de)是它(ta)的(de)(de)啟動子(zi)的(de)(de)選擇，常(chang)用(yong)都是cmv啟動(dong)子(zi)的(de)(de)，表達效率(lv)較高，也有多種啟動(dong)子(zi)經過(guo)改造的(de)(de)表達載(zai)體，一(yi)般用來(lai)表達需要調控表達時間及表達量的(de)(de)蛋白。

①選分子量小的質粒，即小載體（1-1.5kb）→不易損壞(huai)，在(zai)細菌里面拷貝數也(ye)多（也(ye)有大(da)載體）；

②一(yi)般使(shi)用松弛(chi)型質粒(li)在(zai)細菌里擴增(zeng)不受(shou)約(yue)束，一(yi)般10個以上的拷貝，而嚴謹(jin)型(xing)質(zhi)粒<10個；

③必需具備一(yi)個以上的酶(mei)切位點(dian)，有選擇(ze)的余地；

④必需(xu)有(you)易檢測的標記，多(duo)是抗生素的抗性基因。

①對于無起始密碼(ma)子和終止(zhi)密碼(ma)子的基因，插(cha)入無標簽的載體(ti)要加(jia)入起始密碼(ma)子和終止(zhi)密碼(ma)子。

②載體N端(duan)有標簽，上(shang)游(you)引物(wu)(wu)要對(dui)讀(du)碼(ma)框；下游(you)引物(wu)(wu)要加終止(zhi)密(mi)碼(ma)子(zi)(為了保(bao)證(zheng)基因(yin)的表達,少(shao)翻譯載體序(xu)列) 。

鏈接：對讀碼(ma)框是為了防止移碼(ma)，是不是移碼(ma)要看載體(ti)圖(tu)譜，看酶(mei)切位(wei)點。從(cong)ATG開(kai)始(shi)，要保證三個堿(jian)基(ji)(ji)編(bian)碼(ma)的(de)氨基(ji)(ji)酸不能影(ying)響(xiang)插(cha)入(ru)(ru)目的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)正常(chang)編(bian)碼(ma)，若(ruo)影(ying)響(xiang)了插(cha)入(ru)(ru)目的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)正常(chang)編(bian)碼(ma)就要在(zai)設計(ji)引(yin)物的(de)時(shi)候在(zai)酶切位點前或者后插(cha)入(ru)(ru)一個或者兩個堿(jian)基(ji)(ji)，總之是(shi)不能影(ying)響(xiang)插(cha)入(ru)(ru)目的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)正常(chang)編(bian)碼(ma)蛋白。有(you)的(de)酶切位點含有(you)起始(shi)密(mi)碼(ma)子，如果(guo)標簽(qian)在(zai)C端(duan)像Nco I就有(you)一個ATG，這時候需要(yao)加堿基在(zai)酶切位點(dian)后面。

③載體C端(duan)有(you)標簽，上游引(yin)物要加(jia)起始密碼子，且考(kao)慮是否加(jia)Kozak序列（真(zhen)核表達系統）；下(xia)游引物要對讀碼框，并且要去掉基(ji)因本身的終(zhong)止密碼子(zi)（保證C端標簽表(biao)達）。

鏈接：Kozak序列是位于真核生(sheng)物(wu)mRNA 5’端帽子(zi)結構后面的一(yi)段核酸序列，通常是GCCGCCRCC（常見的序列是GCCACC），位(wei)于起始密碼子（ATG）之前。它可以(yi)與翻(fan)譯起(qi)始因子結合而介導含有5’帽(mao)子結構(gou)的(de)mRNA翻譯起(qi)始。在真核生(sheng)物中，該序列(lie)相對比(bi)較(jiao)保守。對應于(yu)原核生(sheng)物的(de)SD序(xu)列（原核基(ji)因在mRNA5’端起(qi)始密碼子AUG上游一(yi)段對mRNA的(de)翻譯起作用的(de)序列）。

添加Kozak序(xu)列(lie)的好處：核糖(tang)體需(xu)要Kozak序列進行穩定結合有(you)助于(yu)提高真核基因(yin)的轉錄和翻譯(yi)的效率。

三、改造載(zai)體

1、改造啟動子：一般在過表達載體中CMV屬于廣譜型的強(qiang)啟(qi)動子，具體可根據實(shi)驗(yan)需求，選用不同啟(qi)動子，尤其是對于AAV載(zai)體構建時(shi)選用組(zu)織特異性啟動子。

2、實驗目的的需要：

①構建過表達or干擾載體(ti)

根據實驗用(yong)途(tu)選擇(ze)載(zai)體(ti)，如過表達載(zai)體(ti)通常選用(yong)CMV啟(qi)動子(zi)，CMV因其集中(zhong)了細(xi)胞轉錄因子(zi)結合(he)位點而具(ju)有異常高的(de)活性(xing)，是公認的(de)真核表達中(zhong)的(de)增強子(zi)，一般插(cha)入某個基因的(de)CDS區到(dao)CMV啟動子下游，CMV負責啟動該基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達，從而(er)達到調(diao)高該基(ji)因(yin)表(biao)達的(de)作用；而(er)U6和H1更多的是用(yong)于shRNA的啟動來達到敲低一個基因的作用，U6和(he)H1啟動(dong)子都是RNA聚合酶(mei)Ⅲ依賴的啟(qi)動子，其特點是啟(qi)動子自身元素(su)均(jun)位于(yu)轉(zhuan)錄區的上游，適合于(yu)表(biao)達(da)約21個核苷酸和約50個核苷酸莖環(huan)結(jie)構（stem loop），RNA聚合酶(mei)Ⅲ有明確的起始和(he)終止(zhi)序列，當(dang)RNA聚(ju)合酶Ⅲ到(dao)連(lian)續4個或5個T時，它指導的轉(zhuan)錄就會停止。

我們公(gong)司的shRNA病(bing)(bing)毒載(zai)體（包括腺病(bing)(bing)毒載(zai)體、慢病(bing)(bing)毒載(zai)體和(he)腺相關病(bing)(bing)毒載(zai)體）是(shi)由U6或H1 啟動shRNA 實現，并(bing)連接了報(bao)告基因，可以實時監測載體(ti)的(de)轉(zhuan)染(ran)效率(lv)。構建干(gan)擾載體(ti)針對目的(de)基因（目的(de)基因需要大(da)于0.7kb，若小于0.7kb需要(yao)評估(gu)來確(que)保(bao)能設計出8條shRNA序列(lie)），設計(ji)并提供4個針(zhen)對靶基因的shRNA產(chan)品，確保4個shRNA中的(de)1個產品在細(xi)胞感染效率達80%以上的前提(ti)下，在mRNA水(shui)平至少有70%的沉默效(xiao)果；也可以按照客戶的要求來設(she)計，由(you)客戶確定(ding)shRNA 序(xu)列的長度(du)，對于每條選定的靶序(xu)列，設計正義(yi)鏈和(he)反義(yi)鏈，以(yi) loop莖環結構相(xiang)連，合成(cheng)shRNA。

②是否攜帶(dai)GFP等熒(ying)光標簽

攜帶熒(ying)光(guang)標(biao)簽(qian)基(ji)本目的是(shi)(shi)(shi)為了觀(guan)察感(gan)染(ran)目的細胞(bao)的效率；攜帶該標(biao)簽(qian)的好(hao)處之一(yi)是(shi)(shi)(shi)不(bu)(bu)用破碎組(zu)織細胞(bao)和不(bu)(bu)加任(ren)何(he)底物，直接通過熒(ying)光(guang)顯(xian)微鏡就能在活(huo)細胞(bao)中發出(chu)綠(lv)色(se)熒(ying)光(guang)，實時(shi)顯(xian)示目的基(ji)因的表達及定(ding)位(wei)情(qing)況(kuang)，而且熒(ying)光(guang)性(xing)質(zhi)穩定(ding)。但是(shi)(shi)(shi)，由于GFP標簽(qian)比(bi)較大（約720bp），這種大標簽在位置上對(dui)目的(de)(de)基(ji)因(yin)造成了空間位阻作(zuo)用(yong)，對(dui)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)空間結構產生(sheng)一定(ding)影響，從而不利(li)于目的(de)(de)基(ji)因(yin)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)本身的(de)(de)活性(xing)及正(zheng)常功能的(de)(de)發(fa)揮。此外(wai)，還需要結合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)本身的(de)(de)特性(xing)，比(bi)如該蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)為具有(you)切(qie)割活性(xing)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)，即(ji)使融合(he)了GFP，標(biao)簽(qian)很(hen)有可能會(hui)(hui)被破(po)壞，終究會(hui)(hui)影(ying)響(xiang)GFP的(de)熒光(guang)及(ji)基本功能。一(yi)般(ban)不(bu)建議融合這(zhe)么大的(de)標(biao)簽，實驗需(xu)要帶熒光(guang)標(biao)簽，建議構建載體(ti)時通過(guo)P2A非(fei)融(rong)合。

③是否融(rong)合6×His、HA、Myc、FLAG等小標(biao)簽(qian)

為了做免疫共沉淀實(shi)驗(yan)或者WB檢(jian)測蛋(dan)白表達,需要(yao)加(jia)融合(he)小標簽。多數情(qing)況下(xia),由于(yu)多肽標簽相(xiang)對較小(xiao)，對目(mu)的蛋(dan)白(bai)質結構影響小(xiao)。但是(shi)在蛋(dan)白(bai)合成(cheng)肽鏈(lian)的過程中，如果影響了蛋(dan)白(bai)的折疊，也會造成(cheng)目(mu)的蛋(dan)白(bai)活性的下降甚至(zhi)功能的喪失(shi)。

④是否含有表(biao)達(da)系(xi)統元件，即(ji)啟動(dong)子－核糖(tang)體結合位點(dian)－克隆位點(dian)－轉錄終止(zhi)信號(hao)。

鏈接：啟動子(zi)：促進DNA轉錄的DNA序列，這個DNA區(qu)域常在基因或操縱(zong)子編碼區(qu)的上游，是(shi)DNA分子上可以與(yu)RNA聚合酶特(te)異性結合并(bing)使之開(kai)始(shi)轉(zhuan)錄(lu)的部位，但啟(qi)動子本身不被(bei)轉(zhuan)錄(lu)。

增強(qiang)子：為(wei)真核基(ji)(ji)(ji)因組（包(bao)括真核病毒基(ji)(ji)(ji)因組）中的(de)一種具有增強(qiang)鄰近基(ji)(ji)(ji)因轉(zhuan)錄過程的(de)調控順序，其作(zuo)用與(yu)其所(suo)在的(de)位置或方向(xiang)無關(guan)。即在所(suo)調控基(ji)(ji)(ji)因上游或下游均可發揮作(zuo)用。

沉默子(zi)(zi)：負(fu)增強子(zi)(zi)，負(fu)調控序列。

起作用的序列(lie)。

轉錄終止順序(xu)（終止子(zi)）/翻譯終(zhong)止密碼子(zi)：結構(gou)基因的最后一個(ge)外顯子(zi)中有一個(ge)AATAAA的保(bao)守序列，此(ci)位點下游有一(yi)段GT或T富豐(feng)區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。

3、載體中P2A和IRES的選擇：

四、影(ying)響載體選擇(ze)的因素：

? 原核表達 or 真(zhen)核表達

? 細胞實驗 （過表達 or 干擾(rao)、瞬時表達 or穩轉株(zhu)、基因大小、熒光、藥篩 ）

?動物實(shi)驗 （過表達 or 干(gan)擾、注(zhu)射部位、基因大(da)小、觀察周期 ）