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上述如此絢麗多(duo)彩的圖(tu)片(pian)是科(ke)學(xue)(xue)家采用2007年哈佛大(da)學(xue)(xue)腦(nao)科(ke)學(xue)(xue)中(zhong)心開發的Brainbow（彩虹腦(nao)）技術(shu)對小鼠海馬(ma)齒(chi)狀回DG進行多(duo)色標(biao)記的結(jie)果。
Brainbow是一項采用含多色熒光蛋白XFP的重組載體標記大腦的成像技術，其技術精髓就是XFP，技術核心是Cre/Loxp系統。具體來說，在Cre/Loxp系統的刪除或(和)顛倒作用下， 由單個啟(qi)動子(zi)在一種(zhong)細(xi)胞群中驅動兩到四個XFP隨機表達；多個Brainbow轉基因(yin)拷貝的(de)整合(he)誘發這(zhe)些(xie)XFP的(de)組合(he)表達，從(cong)而(er)創造出更多的(de)色(se)彩。在神(shen)經系統(tong)中，由此產(chan)生的(de)多色(se)標(biao)記可以用來(lai)區分相(xiang)鄰的(de)神(shen)經元細(xi)胞或膠質細(xi)胞，并在追蹤神(shen)經環(huan)路的(de)同時確定神(shen)經元突起的(de)身(shen)份，從(cong)而(er)幫助(zhu)科學家(jia)解(jie)析大腦。
那么，作為Brainbow技術精髓的XFP，我(wo)們(men)又了解(jie)多少呢？本期(qi)我(wo)們(men)將(jiang)帶領大家深入、全面地了解(jie)熒光(guang)蛋白。
熒光物質、激發光和熒光
我們在對樣品進行熒光成像時，首先樣品需要進行熒光標記，其次用某種波長的入射光進行照射，吸收光能后進入激發態，并且立即退激發并發出比入射光波長更長的發射光。在這過程中，用來標記樣品并使其具有發光性質的物質叫熒光物質，而照射樣品的入射光叫激發光，發出來的發射光就叫熒光。
發光原理
當(dang)熒(ying)光(guang)(guang)物(wu)(wu)質被(bei)激發光(guang)(guang)照(zhao)射后(hou)，激發光(guang)(guang)的(de)能(neng)(neng)量(liang)(liang)就會供(gong)給熒(ying)光(guang)(guang)物(wu)(wu)質，熒(ying)光(guang)(guang)物(wu)(wu)質吸(xi)收能(neng)(neng)量(liang)(liang)后(hou)發生(sheng)能(neng)(neng)級(ji)躍遷，即由(you)低(di)能(neng)(neng)級(ji)的(de)基態躍遷至(zhi)(zhi)高能(neng)(neng)級(ji)的(de)激發態。而(er)高能(neng)(neng)級(ji)的(de)激發態不穩定(ding)，所以會恢復至(zhi)(zhi)低(di)能(neng)(neng)級(ji)的(de)基態。在(zai)這過程(cheng)中(zhong)，熒(ying)光(guang)(guang)物(wu)(wu)質吸(xi)收的(de)能(neng)(neng)量(liang)(liang)就會以光(guang)(guang)的(de)形式進行釋放(fang)，從而(er)產生(sheng)熒(ying)光(guang)(guang)。而(er)事實上(shang)，在(zai)能(neng)(neng)量(liang)(liang)釋放(fang)過程(cheng)中(zhong)還有一(yi)部分是被(bei)喪失(shi)掉的(de)，因此(ci)發射光(guang)(guang)的(de)能(neng)(neng)量(liang)(liang)低(di)于(yu)激發光(guang)(guang)的(de)能(neng)(neng)量(liang)(liang)，相對應地，發射光(guang)(guang)的(de)波(bo)長要比激發光(guang)(guang)的(de)波(bo)長長。熒(ying)光(guang)(guang)物(wu)(wu)質發光(guang)(guang)的(de)整(zheng)個過程(cheng)可用(yong)Jablonski能(neng)(neng)量(liang)(liang)圖(tu)(tu)來表示（圖(tu)(tu)1）。
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熒光光譜
熒光光譜分為激發光譜和發射光譜兩種：激發光譜是熒光物質在不同波長的激發光作用下記錄的熒光強度隨激發光波長的變化情況；而發射光譜則是(shi)在固定(ding)波長(chang)的激發(fa)光(guang)作用(yong)下記(ji)錄的熒光(guang)強度隨發(fa)射光(guang)波長(chang)的變化情況。
無論(lun)(lun)是激發光譜還是發射(she)光譜，記(ji)錄的(de)均(jun)是熒光強調隨(sui)(sui)波(bo)(bo)長(chang)的(de)變化(hua)情(qing)況(kuang)，不同(tong)的(de)是隨(sui)(sui)誰的(de)波(bo)(bo)長(chang)而(er)變化(hua)。電磁波(bo)(bo)波(bo)(bo)普將(jiang)有助于我們了(le)解各波(bo)(bo)普的(de)波(bo)(bo)長(chang)，從而(er)為我們設計實驗提(ti)供(gong)理(li)論(lun)(lun)基(ji)礎（圖2）。
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自1994年GFP首次被用于標(biao)記基(ji)因(yin)后，熒光蛋(dan)白(bai)（Fluorescent proteins，FPs）就成(cheng)了生命科學(xue)領(ling)域中(zhong)(zhong)非常重要的(de)細胞(bao)成(cheng)像工具之(zhi)一(yi)。這些(xie)FPs借(jie)助高分辯率顯(xian)微技術能夠幫助我們(men)觀(guan)察先(xian)前無(wu)法看到的(de)生物(wu)過程，如(ru)活細胞(bao)內(nei)的(de)代謝過程、信號通路，大腦中(zhong)(zhong)的(de)突(tu)觸鏈(lian)接，癌細胞(bao)的(de)擴散等。
熒光蛋白的結構
在(zai)1996年(nian)，GFP的(de)晶體結(jie)(jie)構(gou)被(bei)科學家成(cheng)功(gong)解析：GFP是(shi)典型的(de)β桶形(xing)結(jie)(jie)構(gou)，包括11條(tiao)β折疊和α螺旋：11條(tiao)β折疊緊密交織在(zai)一(yi)起形(xing)成(cheng)圓柱狀的(de)“柵欄”，α螺旋上的(de)第65、66、67位氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)(suan)（絲(si)氨(an)酸(suan)(suan)、酪氨(an)酸(suan)(suan)、甘氨(an)酸(suan)(suan)）位于其(qi)正(zheng)中位置(zhi)，在(zai)分子氧的(de)作用(yong)下(xia)，經過環化、脫(tuo)氫等作用(yong)最終形(xing)成(cheng)成(cheng)熟的(de)熒光基(ji)(ji)團(tuan)，嚴密的(de)桶形(xing)結(jie)(jie)構(gou)保護著熒光基(ji)(ji)團(tuan)，防(fang)止它被(bei)周圍環境(jing)淬滅（圖3a和3b）；N端(duan)和C端(duan)均(jun)暴露(lu)在(zai)外面。
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FPs的種類五花八門，就FPbase中收錄的就831種，幾乎覆蓋了從紫外光到遠紅外光的所有光譜波段。盡管這些FPs的光學特性大相徑庭，但是它們的結構卻極其相似。結構決定功能，人們對FPs結構的深刻認識對于理解其功能及拓展其范圍具有非常重要的理論意義。
合適熒光蛋白的選擇指南
面對琳瑯滿目的(de)FPs，研究人員在具(ju)體(ti)科學研究中往往受到一(yi)系列問題的(de)困擾，如哪些(xie)FPs好用(yong)？哪些(xie)FPs亮度高？哪些(xie)因素影響理想FPs的(de)選擇(ze)？下面我們就從如下幾方面一(yi)一(yi)展開(kai)討(tao)論，旨在為大(da)家縮(suo)小(xiao)選擇(ze)范圍提(ti)供(gong)參考。
①亮度/Brightness
FP的亮度由多種因素決定，包括FP固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系數、量子產量和光穩定性[長期實驗中]決定）、成像設備的光學特性（照射光的波長和強度，濾光片的光譜和二色鏡）和照相機或人眼對發射光譜的敏感性。雖(sui)然這(zhe)些因素無法從整體上鑒定(ding)更(geng)亮的(de)FP，但是(shi)(shi)在各個光(guang)譜波段(duan)(duan)內(nei)還(huan)是(shi)(shi)有可(ke)能鑒定(ding)較亮的(de)FP，因為這(zhe)主要(yao)取(qu)決于其固(gu)有的(de)光(guang)學特性。更(geng)亮的(de)FP意味(wei)著可(ke)以用更(geng)低的(de)激發光(guang)強度進行成像(xiang)，從而更(geng)好地保(bao)護樣品免受光(guang)損傷。而且，更(geng)亮的(de)FP可(ke)以提供檢測和成像(xiang)所(suo)需的(de)足夠信號。下表(biao)是(shi)(shi)各光(guang)譜波段(duan)(duan)推薦的(de)FPs（表(biao)1）。
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②表達/Expression
大多(duo)數FPs來源于海洋生物(wu)(wu)，而我們研究的(de)基因大多(duo)數來自于哺(bu)乳動物(wu)(wu)。這兩種物(wu)(wu)種的(de)密(mi)碼子偏好性存在較大差異，這種差異很(hen)可能會造(zao)成FP在哺(bu)乳動物(wu)(wu)表達(da)系統中低表達(da)甚(shen)至不表達(da)，進而觀(guan)察(cha)不到熒光。因此(ci)，用(yong)于成像(xiang)實(shi)驗的(de)(de)FPs往(wang)往(wang)都需要(yao)根據所(suo)表達系統(tong)進(jin)行(xing)密碼子優(you)(you)化(hua)(hua)，使(shi)其(qi)能(neng)夠很好地(di)表達。慶幸的(de)(de)是，目前我們所(suo)使(shi)用(yong)的(de)(de)FPs已針對哺乳動物的(de)(de)密碼子進(jin)行(xing)了(le)優(you)(you)化(hua)(hua)，而且(qie)可以很好地(di)表達。FPs需要(yao)經歷轉錄、翻譯、折疊、熒光基團形成等步驟形成成熟(shu)蛋白后才能(neng)發光。雖然，大(da)多數經過密碼子優(you)(you)化(hua)(hua)的(de)(de)FPs能(neng)在哺乳動物系統(tong)中很好地(di)表達，但(dan)是其(qi)折疊效率(lv)有快有慢，從而決定了(le)其(qi)成熟(shu)時(shi)間(jian)不(bu)同。因此(ci)，FPs的(de)(de)成熟(shu)時(shi)間(jian)也需考慮(lv)在內(nei)，在進(jin)行(xing)目標(biao)蛋白亞細胞定位(wei)時(shi)，我們需要(yao)根據其(qi)壽命選擇(ze)相應的(de)(de)FP。
③ 光穩定性/Photostability
所有FPs最終都會(hui)在(zai)長時間的激發光(guang)照射下發生(sheng)光(guang)漂白，從而逐漸喪(sang)失發光(guang)能(neng)力，但是其光(guang)漂白速(su)率迥異。因此，針(zhen)對不(bu)(bu)同(tong)的成像實驗(yan)，我們需要選(xuan)擇(ze)不(bu)(bu)同(tong)光穩(wen)定(ding)性的FP：對于需要不(bu)(bu)多于10張圖(tu)片(pian)的短期成像實驗(yan)，光穩(wen)定(ding)性通(tong)常不(bu)(bu)是(shi)一個主要考慮因素，但在(zai)需要大量圖(tu)片(pian)的長期成像實驗(yan)中，選(xuan)擇(ze)極具(ju)光穩(wen)定(ding)性的FP是(shi)實驗(yan)成功的關鍵。
④聚合性質/Oligomerization
對于蛋白亞(ya)細胞定位實(shi)驗，我們(men)在構建(jian)熒光融合蛋白時(shi)要選(xuan)擇(ze)單體性質的(de)FPs，因為多聚體的(de)FPs很可能(neng)會能(neng)影響目標蛋白的(de)功(gong)能(neng)或(huo)定位。
⑤環境敏感性/Environmental sensitivity
大多(duo)數FPs具有(you)不同程度的(de)酸(suan)敏(min)感(gan)性(xing)，有(you)的(de)適合在酸(suan)性(xing)環(huan)境下(xia)使(shi)用，有(you)的(de)適合在堿性(xing)環(huan)境下(xia)使(shi)用，因此，在不同酸(suan)堿度溶液成(cheng)像(xiang)中(zhong)，我們選擇FPs時還需考慮其PK 值(zhi)（用于指示FPs的(de)pH敏(min)感(gan)性(xing)，PK 值(zhi)越小酸(suan)性(xing)越強）。在特定(ding)條件下(xia)，那些對pH敏感(gan)的(de)FPs可以指示細胞內酸(suan)堿度(du)的(de)變化(hua)，例如單標（GFP-LC3B）和雙(shuang)標（mCherry-GFP-LC3B）自(zi)噬指示系統就是(shi)利(li)用了GFP和mCherry不同的(de)酸(suan)敏感(gan)性來追蹤(zong)自(zi)噬流的(de)。
⑥多色標記/Multiple labeling
自(zi)(zi)GFP被首(shou)次用于標記基因后，水母來(lai)源的(de)GFP不斷被改造，得(de)到(dao)了(le)大量(liang)藍色(se)(se)、青色(se)(se)和(he)黃色(se)(se)的(de)衍生物。同(tong)時(shi)，來(lai)自(zi)(zi)其他物種(zhong)的(de)FPs也被陸續(xu)鑒定，進一步將FPs的(de)顏色(se)(se)拓展至橙色(se)(se)、紅色(se)(se)和(he)紅外光譜區。從FPs被改(gai)造的(de)整個過(guo)程，我們可以看出(chu)，FPs的(de)改(gai)造趨向紅移。因為FPs越紅越好，顏色越紅意味著波(bo)長(chang)越長(chang)，對應的(de)激(ji)發光(guang)(guang)波(bo)長(chang)也更長(chang)，長(chang)波(bo)長(chang)光(guang)(guang)的(de)激(ji)發對細胞和(he)組(zu)(zu)織(zhi)的(de)光(guang)(guang)損傷小(xiao)，且(qie)背景(jing)自發熒光(guang)(guang)和(he)動(dong)物組(zu)(zu)織(zhi)的(de)光(guang)(guang)吸收都(dou)非常小(xiao)，組(zu)(zu)織(zhi)穿透(tou)力強(qiang)（圖(tu)4）。這些特征使得紅色FPs更適合于體內深組(zu)(zu)織(zhi)成像。
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這些五顏六(liu)色的FPs為我們選(xuan)擇FPs進(jin)行多色標記實驗提(ti)供了豐(feng)富(fu)的資源(yuan)。值得注(zhu)意(yi)的是，在(zai)選(xuan)擇FPs顏色的同時還要兼(jian)顧它們的兼(jian)容性(xing)：一個好(hao)的經驗法則是，兩種(zhong)FPs的峰(feng)激發波(bo)長(chang)和峰(feng)值發射波(bo)長(chang)均應相隔50-60nm。
⑦設備兼容性/Opitical setup
選擇FPs進行成像實驗時，所選FPs的光譜范圍需滿足實驗室現有成像設備的需求，畢竟重新購買成像設備成本還是比較高的。推薦使用的成像設備濾光片組合見表2。
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熒光蛋白的應用
如(ru)今，FPs作為標(biao)記(ji)蛋(dan)白(bai)和(he)報告蛋(dan)白(bai)被(bei)廣泛應(ying)用(yong)于生(sheng)命(ming)科學研究(jiu)的諸(zhu)多領域(yu)，以研究(jiu)生(sheng)命(ming)系統的組織和(he)功能（圖5）。
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①標記蛋白
作為(wei)標(biao)(biao)記蛋白(bai)，構建熒光融(rong)合蛋白(bai)(Fluorescent Fusion Protein, FFP)可(ke)(ke)以(yi)用于(yu)研究蛋白(bai)定位(wei)，追蹤其動態變化(hua)，追溯其歷史和(he)研究蛋白(bai)之間的(de)相互作用。那么，如何構建FFP呢？在(zai)設計(ji)FFP時(shi)，我(wo)(wo)們需(xu)要考(kao)慮多(duo)(duo)方面的(de)因素，如FFP的(de)預期用途，選(xuan)擇哪種FP，插入位(wei)置等(deng)(deng)等(deng)(deng)。隨著(zhu)FPs的(de)發現和(he)發展，很多(duo)(duo)熒光蛋白(bai)載(zai)體(ti)可(ke)(ke)通(tong)過商業化(hua)公(gong)司獲得。縱觀這些載(zai)體(ti)，FP通(tong)常(chang)位(wei)于(yu)多(duo)(duo)克(ke)隆(long)位(wei)點附近（即目標(biao)(biao)蛋白(bai)的(de)N端或(huo)C端，圖6）。在(zai)根(gen)據上述FP選(xuan)擇指南選(xuan)定載(zai)體(ti)后，我(wo)(wo)們僅(jin)需(xu)通(tong)過簡單的(de)亞(ya)克(ke)隆(long)技術(shu)將目標(biao)(biao)蛋白(bai)克(ke)隆(long)至多(duo)(duo)克(ke)隆(long)位(wei)點區即可(ke)(ke)。當FP位(wei)于(yu)目標(biao)(biao)蛋白(bai)C端時(shi)，為(wei)了確保兩者的(de)正確折疊和(he)功能，一段由2-10個(ge)氨基酸組成的(de)鏈接序列（GS間隔(ge)，linker）往往是(shi)有(you)用的(de)。
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但是，在許多(duo)情(qing)(qing)況(kuang)下(xia)，我們需要(yao)根據目標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)實際(ji)情(qing)(qing)況(kuang)修飾(shi)FFP，如(ru)內(nei)質網(wang)(wang)蛋(dan)(dan)白(bai)和膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)：一個(ge)典型的(de)內(nei)質網(wang)(wang)蛋(dan)(dan)白(bai)通(tong)常(chang)含有(you)兩段(duan)關鍵序(xu)列(lie)（信號(hao)序(xu)列(lie)，SS；內(nei)質網(wang)(wang)滯留(liu)序(xu)列(lie)，KDEL），若其(qi)功能(neng)域靠近C端(duan)，FP應置于(yu)SS下(xia)游2-10個(ge)氨基(ji)酸處，這樣可以提(ti)高SS的(de)切(qie)割效(xiao)率，并(bing)有(you)利于(yu)FFP的(de)內(nei)質網(wang)(wang)易位(wei)；若其(qi)功能(neng)域靠近N端(duan)，FP應插入KDEL之前(qian)；對(dui)于(yu)單次(ci)跨膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)，FP不能(neng)置于(yu)跨膜(mo)(mo)(mo)結(jie)構域(TMD)內(nei)/附近，因為(wei)(wei)這將破(po)壞結(jie)構域并(bing)導(dao)致膜(mo)(mo)(mo)整合(he)的(de)問(wen)題；對(dui)于(yu)多(duo)次(ci)跨膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)，除了(le)單次(ci)跨膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)不適位(wei)置外，FP也不可置于(yu)TMDs之間的(de)環內(nei)，因為(wei)(wei)TMDs之間的(de)精確間距對(dui)于(yu)其(qi)正確折疊非常(chang)重要(yao)，且這些環通(tong)常(chang)包含功能(neng)域（圖7）。另外，還有(you)些目標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)在成熟(shu)過程中會切(qie)掉一段(duan)，如(ru)自噬標(biao)志物(wu)LC3。
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總(zong)之(zhi)，不管如何構建FFP，我們均需要確保(bao)FFP的序(xu)列正確，并(bing)通過實(shi)驗確認(ren)其(qi)是否(fou)發(fa)光，其(qi)定位模式是否(fou)與目標蛋(dan)(dan)白(bai)的類似，是否(fou)保(bao)留(liu)有(you)目標蛋(dan)(dan)白(bai)的功能等等。
②報告蛋白
作為報告蛋白，FPs借助極具市場前景的AAV病毒載體被廣泛應用于神經科學研究的各個階段，包括神經標記，基因操作，生理操縱和生理觀察。下面我們僅列舉幾個例子說明：
案例1：FPs用于標記全腦和局部腦區的神經細胞（圖8）
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隨(sui)著(zhu)技術的(de)(de)(de)進步，越(yue)來越(yue)多的(de)(de)(de)FPs被(bei)開發并應用。因此，科(ke)研(yan)人(ren)(ren)(ren)對(dui)于(yu)FPs可(ke)以說是(shi)眾(zhong)所周知。盡管目前已有的(de)(de)(de)FPs為科(ke)研(yan)人(ren)(ren)(ren)的(de)(de)(de)各種成像(xiang)實(shi)驗帶(dai)來了眾(zhong)多選擇。但是(shi)，隨(sui)著(zhu)研(yan)究的(de)(de)(de)深入，科(ke)研(yan)人(ren)(ren)(ren)對(dui)于(yu)成像(xiang)實(shi)驗提出了更(geng)高的(de)(de)(de)需求，尤(you)其在(zai)(zai)神經(jing)(jing)網絡縱橫交錯的(de)(de)(de)神經(jing)(jing)系(xi)統中體現地淋(lin)漓盡致。未來，亮(liang)度高、穩定性高的(de)(de)(de)單體FPs將可(ke)以進行(xing)更(geng)密集的(de)(de)(de)成像(xiang)實(shi)驗；高效折疊的(de)(de)(de)單體光(guang)轉(zhuan)換(huan)FPs將提高我們光(guang)標記融合(he)蛋白的(de)(de)(de)能(neng)力，FPs光(guang)譜的(de)(de)(de)長波長端將繼續拓寬，使科(ke)研(yan)人(ren)(ren)(ren)能(neng)夠在(zai)(zai)深組織和整個動物中進行(xing)更(geng)靈敏(min)、更(geng)高效的(de)(de)(de)成像(xiang)實(shi)驗。
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