關于慢病毒的知識分享

什么情況下選用慢病毒載體？

慢病(bing)毒(du)（Lentivirus）是一類改造(zao)自人免(mian)疫缺陷(xian)I型病(bing)毒(du)的(de)病(bing)毒(du)載體，是逆轉錄病(bing)毒(du)的(de)一種，基(ji)(ji)因組是單鏈(lian)RNA。區別于腺(xian)病(bing)毒(du)和腺(xian)相關(guan)病(bing)毒(du)，慢病(bing)毒(du)能夠介(jie)導外(wai)源基(ji)(ji)因整合至(zhi)宿(su)主(zhu)基(ji)(ji)因組，實現(xian)基(ji)(ji)因長(chang)時間穩定表達，是體內(nei)外(wai)基(ji)(ji)因傳遞(di)的(de)有效工具。

那什么情(qing)況下可以選用慢病毒載(zai)體(ti)呢(ni)？ 這就需要根據實驗目的(de)和慢病毒的(de)特點來(lai)進行選擇(ze)：

1. 如果需要感染的目的細胞是一些難轉染的細胞（如原代細胞、干細胞、不分化的細胞）或者是對腺病毒感染具有較強免疫反應的細胞（如樹(shu)突狀(zhuang)細胞(bao)(bao)、單(dan)核細胞(bao)(bao)和間充質(zhi)干細胞(bao)(bao)）時，可以選擇慢病毒載體，能(neng)大大提高目的基(ji)因轉(zhuan)導效率及整合至(zhi)宿主(zhu)基(ji)因組幾率。

2. 慢病毒的宿主范圍廣泛，既能感染分裂細胞，也能感染非分裂細胞，所以體內外研究中均可以選用慢病毒作為病毒載體。如果需要構建活體動物模型，尤其是動物成瘤實驗，慢病毒是很(hen)好的選(xuan)擇。

3. 當需要將外源基因整合到宿主染色體上，實現目的基因穩定、長期的表達時，或者后續需要構建穩轉株，那么(me)慢病毒則是理(li)想選擇。

4. 慢病毒載體也可以改造T細胞用于CAR-T細胞治療和基因治療。與其他(ta)病(bing)(bing)毒載體相比(bi)，慢(man)病(bing)(bing)毒生產(chan)成本(ben)相對較(jiao)低(di)，而且整(zheng)合模式致癌(ai)風險較(jiao)低(di)，因此用慢(man)病(bing)(bing)毒載體生產(chan)CAR-T細胞更(geng)加經濟(ji)且安全有效。

影響慢病毒感染效率的因素

慢病(bing)毒(du)既可(ke)以感染(ran)(ran)(ran)分(fen)裂細(xi)胞與非分(fen)裂細(xi)胞，還(huan)能將外源基(ji)(ji)因(yin)整合到(dao)宿主染(ran)(ran)(ran)色體(ti)上，從而實現長期穩定的表達，是體(ti)內(nei)和體(ti)外基(ji)(ji)因(yin)傳遞的有效工具。然而慢病(bing)毒(du)感染(ran)(ran)(ran)效率(lv)受(shou)到(dao)多種因(yin)素(su)的影(ying)響(xiang)，今(jin)天就一起分(fen)析一下(xia)影(ying)響(xiang)慢病(bing)毒(du)感染(ran)(ran)(ran)效率(lv)的因(yin)素(su)：

1. 病毒本身

首先，考慮病毒包裝制備是否存在問題，比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等。其次，考慮病毒運輸和保存方式是否得當，解凍病(bing)毒(du)一定要在冰(bing)上進行，盡量避免反復凍融，否(fou)則會(hui)影響病(bing)毒(du)滴度；分(fen)裝的病(bing)毒(du)-4℃可以保存(cun)3天，-80℃保存(cun)半年以上需要重新(xin)測定滴度。

2. 細胞狀態

細胞良好的生長狀態是達到高感染效率的保證，一般選擇細胞形態較好、輪廓清晰、處于對數生長期的細胞進行感(gan)染(ran)可(ke)提高感(gan)染(ran)效(xiao)率。

3. MOI值

理論上MOI值越大，慢病毒感染上的可能性也越大，感染效率越高，但對細胞的毒性也越大（需要的MOI值越大，表明目的細胞越難被感染，慢病毒對細胞的毒性也越大）。所以實驗中可以通過預實驗確定合適的MOI值來達到相對較高的細胞存活率和病毒感染率。

4. 感染時間

慢病毒一般在感染后24h換液。感染后換液太早會導致感染效率下降;感染后換液太晚，則對細胞的損傷太大，效率也不高（如果慢病毒對細胞有明顯毒性，可根據細胞生長狀態在4-24h后換液）。由于慢病毒的表達較慢，熒光表達所需時間較長，可在感染72~96h后觀察熒(ying)光(guang)的(de)表(biao)達。

如何確定合適的慢病毒MOI值？

MOI（multiplicity of infection），即感(gan)染(ran)(ran)復(fu)數，指的是感(gan)染(ran)(ran)時病(bing)毒與細胞數量的比值(zhi)。一(yi)般(ban)認為MOI是一(yi)個比值(zhi)，沒有單位。合適的MOI值(zhi)是高感(gan)染(ran)(ran)效率的關(guan)鍵因素之一(yi)，那么如(ru)何確定合適的MOI值(zhi)呢？

1. 查閱相關文(wen)獻，推(tui)薦查閱與(yu)目的細胞(bao)的種類(lei)、細胞(bao)狀(zhuang)態、實驗條件相似的有參考(kao)性(xing)的文(wen)獻，對MOI值的適宜范圍有基(ji)本(ben)的了解。

2. 進行預實(shi)(shi)驗(yan)，因慢病毒種類、實(shi)(shi)驗(yan)條件、細(xi)胞狀(zhuang)態、實(shi)(shi)驗(yan)人員(yuan)熟練程度(du)等的(de)(de)不同，文獻報道的(de)(de)MOI值也只能作為參考，推薦正式實(shi)(shi)驗(yan)前(qian)在目的(de)(de)細(xi)胞中進行預實(shi)(shi)驗(yan)（如梯度(du)實(shi)(shi)驗(yan)）來摸索合適的(de)(de)MOI值。

3. 選取預實驗中細胞狀態較好、熒(ying)光較多的孔對(dui)應的MOI值作為正(zheng)式實驗時使用的MOI值。

下面提供(gong)一種慢病(bing)毒(du)感染細(xi)胞的預(yu)實(shi)驗以摸(mo)索MOI值(zhi)的操(cao)作步(bu)驟(zou)以供(gong)參(can)考(kao)：

慢病毒感染各類細胞的MOI值

別人的慢病毒感染實驗進行的如火如荼，你還在苦苦翻閱文獻查找MOI值？別急，我們來了！經過大量文獻的查閱，總結了常用人源、鼠源細胞的MOI值供您參考。

慢病毒感染后，為什么細胞生長不好？

慢病毒感染后，細胞可能會出現生長狀態變差或有大量黑點出現進而影響生長等問題，下面就一起分析一下這些問題出(chu)現(xian)的(de)原因及解決方法：

1.慢病毒感染后，細胞狀態很差，甚至出現死亡：

病毒溶液中殘留的雜質蛋白、內毒素等會對細胞造成一定的毒性，不同細胞對毒性的耐受力不同。如果所選擇的目的細胞對慢病毒比較敏感，則可能出現細胞狀態變差甚至死亡的現象。針對這種狀況有以下幾點解決方法：一是保證感染前細胞的生長狀態良好；二是使用高純度高滴度的慢病毒，并適當降低感染時使用的MOI值，即可在細胞準備感染時增加鋪板細胞的融合率（可提高至70%），調整感染時加入的病毒量；三是根據細胞狀態，可選擇在感染4小時后換液，用新鮮的完全(quan)培養液繼(ji)續培養觀察。

2.慢病毒感染后細胞中出現大量黑點，并影響細胞生長：

在排除細菌及真菌污染后，細胞中的黑點通常為細胞碎片。在慢病毒感染后，細胞破碎通常有兩個原因：a、慢病毒使用量過多，或細胞數量過少；b、支原體污染。由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長增殖，故支原體污染被許多實驗室所忽略。但支原體在病毒感染細胞后爆發，故會出現大量細胞碎片。針對以上原因建議的解決方法有：一是調整MOI值，確定合適的病毒使用量；二在使用病毒制品時，應首先排除細胞、培養物及培養環境中的支原體污染，以保證實驗的順利進行。

助感染試劑 ‖ 提高你的慢病毒感染效率

慢病(bing)毒已(yi)作為細胞治療的(de)(de)理想載體得到廣泛應用，然(ran)而在(zai)感(gan)染過程中(zhong)仍會出(chu)現感(gan)染效率低的(de)(de)問(wen)題(ti)，下面就(jiu)介(jie)紹兩種可以提(ti)高慢病(bing)毒感(gan)染效率的(de)(de)助感(gan)染試劑，一起來圍觀吧~

1.慢病毒轉導增強劑（Lentiviral Transduction Enhancer，LVTE）

懸浮細胞是一類生長不依賴支持物表面，在培養液中呈懸浮狀態生長的細胞。與貼壁細胞相比，懸浮細胞難培養，易死亡，且不易轉染。維真生物團隊研發的慢病毒轉導增強劑 LVTE 可以解決這一難轉染問題，其使用原理是增強膜的通透性和細胞內外的跨膜轉運，促進慢病毒進入靶細胞，進而大大提升慢病毒對懸浮細胞這類難感染細胞的感染效率。

使用方法：

（1）直接加入法（適用于較易感染的細胞類型）

①進行(xing)病(bing)毒(du)感染時，將LVTE稀釋100倍直接加入培養皿(min)/孔/瓶(ping)中，混勻即可；

②后續操(cao)作過程(cheng)依據病毒類型和(he)實驗需(xu)要(yao)而定；

（2）離心法（適用于較難感染的細胞類型）

以“24孔(kong)培(pei)養(yang)板、人原代(dai)T細胞”為例：

① 準備(bei)細(xi)(xi)胞將狀態良好(hao)的目的細(xi)(xi)胞接種到 24 孔板中，每孔按5×10E5個(ge)待感染(ran)細(xi)(xi)胞鋪板，每孔400uL培養基；

② 選(xuan)擇合(he)適的(de)MOI值于(yu)24孔板中加入慢病(bing)毒，再(zai)加入4uL慢病(bing)毒轉導增(zeng)強劑LVTE，輕輕混勻，800g室(shi)溫離心45min；

③ 離心后將(jiang)24孔板(ban)置于37℃、5%CO2 培養箱中靜置5-6h；

④ 靜置完成后在(zai)培(pei)養體系中(zhong)補加800uL培(pei)養基繼續培(pei)養；

⑤ 48-72h后鑒定(ding)病毒(du)感染效(xiao)率(lv)。

LVTE在慢病毒感染凍存人原代T細胞中的效果
（左圖：未添加LVTE 右圖：添加LVTE）

2.慢病毒/腺病毒助感染試劑（ADV-HR）

維真團隊研發的 ADV-HR 通過物理吸附將病毒富集在細胞表面，從而增加病毒對細胞的感染效率，起到助感染的效果，可以提高貼壁細胞的病毒感染效率。此試劑既可以用于慢病毒感染，也可以用于腺病毒感染過程。高濃度的(de)ADV-HR具有(you)細(xi)胞毒性(xing)，影響(xiang)細(xi)胞狀態(tai)和感(gan)染效率，建議您(nin)務必于目的(de)細(xi)胞中進(jin)行ADV-HR濃度梯(ti)度預實驗。

使用方法：

（1）直接加入法（適用于較易感染的細胞類型）

進行病(bing)(bing)毒感染時，將ADV-HR、慢病(bing)(bing)毒直接加(jia)入培養皿/孔/瓶中，混勻即可。

（2）孵育法（適用于較難感染的細胞類型）

將ADV-HR、慢病毒和一定數量的(de)細胞懸液加(jia)(jia)至1.5mL Eppendorf 管中(zhong)，輕輕混(hun)勻(yun)，置(zhi)于37℃細胞培養箱(xiang)中(zhong)孵育0.5-1個小時后(hou)轉移至預先加(jia)(jia)有(you)2ml培養液的(de)6孔板中(zhong)，37℃、5%C02培養箱(xiang)中(zhong)培養。后(hou)續操作依病毒類型和實(shi)驗需要而定。

ADV-HR在慢病毒感染HepG2&CNE2中的效果