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分子克隆技術又稱基因克隆或DNA重組技術，是在(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)外對DNA分(fen)(fen)子(zi)按照(zhao)既定的目的和(he)方案進行人工重組，然后將重組分(fen)(fen)子(zi)（目的基因(yin)或DNA片(pian)段與合適(shi)的載體(ti)(ti)(ti)連(lian)接）導入到合適(shi)的受體(ti)(ti)(ti)細(xi)胞(bao)中，使其在(zai)(zai)細(xi)胞(bao)中復制(zhi)與擴增，以獲(huo)得多(duo)拷貝的DNA分(fen)(fen)子(zi)，并使受體(ti)(ti)(ti)細(xi)胞(bao)獲(huo)得新的遺傳特征的過程。
1. 目的基因克隆
從特(te)定(ding)的生(sheng)物基(ji)因(yin)組或cDNA中(zhong)分離和擴(kuo)大繁(fan)殖(zhi)獲得足夠量(liang)的目的基(ji)因(yin)或 cDNA序(xu)列。
2. 載體的準備
選擇(ze)合適的載體(ti)，并對載體(ti)DNA進行克(ke)隆，制備(bei)足(zu)夠量的達到一定(ding)純度的載體(ti)。
3. 目的基因與載體的酶切、連接
選擇適當的(de)(de)克(ke)隆策略，將(jiang)目的(de)(de)基因(yin)連(lian)接于載體的(de)(de)多克(ke)隆位點(dian)或啟動(dong)子和終止子之間，實現 DNA 重(zhong)組。
4. 重組DNA轉化/轉染/轉導
將重組DNA轉(zhuan)化/轉(zhuan)染/轉(zhuan)導進(jin)入大腸(chang)桿菌細(xi)胞(bao)、酵母(mu)菌細(xi)胞(bao)、植(zhi)物(wu)外植(zhi)體或動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)。
5. 重組體的篩選與鑒定
利用載體上提(ti)供的(de)選(xuan)擇(ze)標記基(ji)(ji)(ji)因(yin)進行(xing)篩選(xuan)，獲得(de)具(ju)有重組DNA分(fen)子的(de)陽性(xing)克隆，或(huo)通過植(zhi)株再(zai)生、胚移植(zhi)等手(shou)段獲得(de)轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)植(zhi)株或(huo)轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)動物。還需對所獲得(de)的(de)轉(zhuan)化細胞、轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)植(zhi)株或(huo)轉(zhuan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)動物進行(xing)分(fen)子鑒定。
6. 重組體的大量培養，外源基因表達效應分析與開發應用
將經篩選和鑒定出來的大腸桿菌、酵母轉化細胞進行(xing)大量擴(kuo)大繁殖，對外源基因的表達蛋(dan)白(bai)進行(xing)分離與純化并(bing)進行(xing)后(hou)續結構與功能的研究。
載體(ti)是用于攜帶重組DNA，并且能夠使外(wai)源DNA一(yi)起復制與表(biao)達的運載工(gong)具。
質粒是一(yi)種獨立(li)于宿主細胞染色(se)體以外，能(neng)獨立(li)自(zi)主復制的(de)遺傳單位。它(ta)們常(chang)(chang)見的(de)形式是細菌(jun)中環狀的(de)雙(shuang)鏈DNA分子，有(you)的(de)也(ye)存(cun)在于古(gu)細菌(jun)和真核生物中，其大(da)小在1～200kb不等(deng)。質粒是“裸(luo)”DNA，不編碼(ma)必要的(de)基因，在自(zi)然界中，質粒通常(chang)(chang)攜帶有(you)利于有(you)機(ji)體生存(cun)的(de)基因，并賦予諸如抗生素耐藥性等(deng)選擇優(you)勢(shi)。
質粒在遺(yi)傳工程(cheng)中占(zhan)有重(zhong)要(yao)的位(wei)置(zhi)，它被認(ren)為是復制(zhi)子(zi)，能(neng)夠在合適的宿(su)主內自主復制(zhi)的DNA單位(wei)，被廣泛用作(zuo)分(fen)子(zi)克隆的載體，驅動宿(su)主體內重(zhong)組DNA序列(lie)的復制(zhi)，在實驗室(shi)中，質粒可以通(tong)過(guo)轉化進入細胞。
質粒可以按照多種方(fang)式進行分類。
1、按照質粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質粒和非接合性質粒。接(jie)合質(zhi)粒(li)含(han)有促進不同細(xi)胞(bao)間性結合的(de)轉(zhuan)(zhuan)移(yi)基因，在復雜的(de)接(jie)合過(guo)程(cheng)中(zhong)，質(zhi)粒(li)可通(tong)過(guo)某(mou)些轉(zhuan)(zhuan)移(yi)基因編碼的(de)性菌(jun)(jun)毛(mao)從一個(ge)細(xi)菌(jun)(jun)轉(zhuan)(zhuan)移(yi)到另一個(ge)細(xi)菌(jun)(jun)，非接(jie)合質(zhi)粒(li)不能(neng)起始接(jie)合，因此只能(neng)借助接(jie)合質(zhi)粒(li)進行(xing)轉(zhuan)(zhuan)移(yi)。
2、根據質粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。一(yi)個(ge)微生物可(ke)以(yi)容納不(bu)同類型的(de)質(zhi)粒，但不(bu)同的(de)質(zhi)粒只有在相(xiang)容的(de)情況(kuang)下才(cai)能(neng)存在于一(yi)個(ge)細菌(jun)細胞中(zhong)。如果(guo)兩個(ge)質(zhi)粒不(bu)相(xiang)容，其中(zhong)一(yi)個(ge)或另一(yi)個(ge)會迅速從細胞中(zhong)消失(shi)。
3、根據復制性質，可分為嚴緊控制型和松弛控制型。嚴(yan)緊控制(zhi)(zhi)(zhi)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)型(xing)(xing)質(zhi)粒(li)的(de)(de)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)酶(mei)系與染色體(ti)DNA復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)共用，只(zhi)能(neng)(neng)在細(xi)胞(bao)(bao)周(zhou)(zhou)期的(de)(de)一(yi)定階段進(jin)行復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)，當(dang)細(xi)胞(bao)(bao)染色體(ti)停止復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)時，質(zhi)粒(li)也就不(bu)再(zai)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)。松弛(chi)控制(zhi)(zhi)(zhi)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)型(xing)(xing)的(de)(de)質(zhi)粒(li)的(de)(de)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)酶(mei)系不(bu)受(shou)染色體(ti)DNA復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)酶(mei)系的(de)(de)影響，在整(zheng)個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)長周(zhou)(zhou)期中隨時都可以(yi)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)，在染色體(ti)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)已經停止時質(zhi)粒(li)仍能(neng)(neng)繼續復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)。
4、此外，根據質粒的功能不同，質(zhi)粒(li)還有(you)如下的(de)分類，如致育質(zhi)粒(li)、抗性(xing)質(zhi)粒(li)、Col質(zhi)粒(li)、降解質(zhi)粒(li)、侵入(ru)性(xing)質(zhi)粒(li)。
用于攜(xie)帶DNA片段(duan)進入宿主(zhu)(zhu)(zhu)細(xi)胞(bao)進行復制或保存的(de)載體必須滿足以下(xia)基本條件：①具(ju)(ju)有(you)(you)(you)對受體細(xi)胞(bao)的(de)可(ke)轉移性，能(neng)攜(xie)帶外源其因(yin)進入宿主(zhu)(zhu)(zhu)細(xi)胞(bao)；②能(neng)在宿主(zhu)(zhu)(zhu)細(xi)胞(bao)中(zhong)自(zi)主(zhu)(zhu)(zhu)復制，并實現外源基因(yin)的(de)增殖；③具(ju)(ju)有(you)(you)(you)由單(dan)一限制性內切核酸酶識別位點組成(cheng)的(de)多克隆位點（mulfiple cloning site，MCS），可(ke)供外源基因(yin)的(de)插入；④具(ju)(ju)有(you)(you)(you)合(he)適的(de)選擇性標記，用于含有(you)(you)(you)重組質粒(li)的(de)宿主(zhu)(zhu)(zhu)細(xi)胞(bao)篩選。
天然質粒往往存在這樣或那樣的缺陷，不適宜直接用作克隆載體，常需要進行人工改造。結合上述條件，這些改造也就主要集中在以下幾個方面∶
（1）選擇合適的復制起始位點。為了使構建的質粒克隆(long)載體(ti)能在受體(ti)細胞(bao)中進行有(you)效復(fu)制(zhi)(zhi)，且(qie)獲得足夠(gou)數量的拷貝數，需(xu)要改變復(fu)制(zhi)(zhi)起(qi)始位點(dian)，一般選擇(ze)組裝(zhuang)松散型質粒復(fu)制(zhi)(zhi)起(qi)始位點(dian)。
（2）加入合適的選擇標記基因。為(wei)便于重組子篩(shai)選，需(xu)要(yao)在(zai)質(zhi)粒克(ke)隆載體上(shang)加入合適的(de)標記基因(yin)，主要(yao)有(you)β-半乳糖苷酶基因(yin)（lacZ）和抗(kang)生素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)。前者用(yong)于克(ke)隆子藍、白(bai)斑(ban)篩(shai)選；常(chang)用(yong)的(de)抗(kang)生素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)主要(yao)有(you)氨(an)芐青(qing)霉(mei)(mei)素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)其因(yin)（ampicillin resistance gene，ampr)、四環素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)（tetracycline resistance gene，tetr）、氯霉(mei)(mei)素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)（chloramphenicol resistance gene，cmr）、卡那(nei)霉(mei)(mei)素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)其因(yin)（kanamycin resistance gene，kanr）和新霉(mei)(mei)素(su)(su)抗(kang)性(xing)(xing)基因(yin)（neomycin resistance gene，neor）等。
（3）增加或減少酶切位點。質(zhi)(zhi)粒載體利用(yong)限(xian)制性內(nei)切(qie)核(he)酸酶(mei)(mei)識(shi)別位(wei)點(dian)來作(zuo)為外源DNA片(pian)段插(cha)入(ru)的(de)克隆(long)位(wei)點(dian)，這種(zhong)位(wei)點(dian)必須是單(dan)一酶(mei)(mei)切(qie)位(wei)點(dian)，而(er)且數量越多越便(bian)于多種(zhong)類型(xing)末(mo)端的(de)DNA插(cha)入(ru)。可通過刪除天然(ran)質(zhi)(zhi)粒中的(de)部(bu)分(fen)重復的(de)限(xian)制性內(nei)切(qie)核(he)酸酶(mei)(mei)識(shi)別位(wei)點(dian)使之成為單(dan)一酶(mei)(mei)切(qie)位(wei)點(dian)，也可通過增加新的(de)單(dan)一限(xian)制性內(nei)切(qie)核(he)酸酶(mei)(mei)位(wei)點(dian)，在特(te)定(ding)的(de)部(bu)位(wei)（如(ru)在篩選標記基因上）組裝一個(ge)含有多種(zhong)單(dan)一限(xian)制性內(nei)切(qie)核(he)酸酶(mei)(mei)識(shi)別序列的(de)多克隆(long)位(wei)點(dian)（MCS）。
（4）縮短長度。質(zhi)粒(li)轉(zhuan)化受體細胞(bao)的效(xiao)率同質(zhi)粒(li)DNA分子(zi)大(da)小相關，小分子(zi)質(zhi)量質(zhi)粒(li)轉(zhuan)化效(xiao)率較(jiao)高。可通過切去(qu)質(zhi)粒(li)上不必要的片(pian)段，提(ti)高轉(zhuan)化宿主(zhu)細胞(bao)的效(xiao)率，提(ti)高其外源 DNA 片(pian)段的裝載量。
經過改進和創新的克隆載體越來越小、容量越來越大、工作效率越來越高、使用也越來越方便。
病毒載體是指以病(bing)毒為基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)的基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)載體(ti)，具(ju)體(ti)方法是對病(bing)毒基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)進行操(cao)作和(he)(he)改(gai)造，使它攜帶外(wai)源基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)和(he)(he)相關(guan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)元件(jian)，并(bing)被包裝(zhuang)成病(bing)毒顆粒，病(bing)毒載體(ti)是一(yi)種常見的分子生物學工具(ju)。用(yong)于基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)導入(ru)并(bing)能在臨床開展研究的病(bing)毒載體(ti)一(yi)般應具(ju)備以下基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)本條件(jian)：
①攜帶外源(yuan)基因并能包裝成病(bing)毒顆粒；
②介導(dao)外源基因的轉移和(he)表達(da)；
③對人體不致病(bing)；
④在(zai)環境中不(bu)會引(yin)起增殖和傳播(bo)。
非病毒載體一般是指(zhi)質粒DNA，也可以(yi)是無載(zai)體的核(he)酸，如反義寡核(he)苷酸、Ribozyme、siRNA等，它是利用非病毒的載(zai)體材料的物化性質來介導基因的轉(zhuan)移。
（含原核(he)和真核(he)2個復(fu)制(zhi)子，能夠在(zai)原核(he)和真核(he)兩種宿主細胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)，并可以在(zai)真核(he)細胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)有(you)效表(biao)達）。
克隆載體：具(ju)有克隆載(zai)體的基本元(yuan)件（Ori，Ampr，MCS等），可(ke)以攜帶DNA片段或外源基因進(jin)入(ru)受體細胞并(bing)克隆和大量擴(kuo)增DNA片段（基因）的載(zai)體。
表達載體：克隆載(zai)體中加入(ru)一些與表達(da)調控（具有(you)轉錄(lu)/翻(fan)譯所必需的(de)DNA順序）有(you)關的(de)元件即稱(cheng)為表達(da)載(zai)體。
原核表達載體即(ji)能攜帶插入的(de)外源基(ji)因序(xu)列(lie)進入原核(he)細胞中進行表達的(de)載體。
①啟動子
啟動子的強弱是影響表達量的決定因素之一，原核表達載體啟動子主要有lac、 trp、tac、T7噬菌體啟動子和IPL啟動子。乳糖操縱子中lac啟動子的轉錄可通過CAP和cAMP來激活，又被調節基因產生的阻遏蛋白與操縱基因結合所阻止。乳糖類似物 IPTG可與阻遏蛋白結合解除阻礙，因此可用IPTG來調控 lac啟動子的表達。色氨酸啟動子trp的阻遏蛋白須與色氨酸結合才有活性。tac是由lac和trp構建的雜合啟動子，受IPTG的誘導，啟動能力比lac和trp強。T7噬菌體啟動子具有高度特異性，只有T7 RNA聚合酶才能使其啟動，而且T7 RNA聚合酶比大腸桿菌聚合酶活性高得多，可用來高效表達基因。IPL是噬菌體的早期左向啟動子，活(huo)性比trp高(gao)11倍，受溫度(du)的調控(kong)。
②轉錄終止子
在構建表達(da)載體(ti)時，為了(le)穩定載體(ti)系統，防止克(ke)隆的外源基因表達(da)干擾載體(ti)的穩定性，一(yi)般(ban)在多克(ke)隆位(wei)點的下(xia)游插入一(yi)段轉(zhuan)錄終止子。
③核糖體結合位點
轉錄出(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA必須借助宿(su)主細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質合成系統翻(fan)譯(yi)出(chu)目的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)。細胞(bao)中的(de)(de)(de)(de)(de)核糖(tang)(tang)體必須在mRNA上找到有效核糖(tang)(tang)體結合位點以(yi)及其中的(de)(de)(de)(de)(de)SD（Shine-Dalgarno）序列，從而(er)啟動臨(lin)近的(de)(de)(de)(de)(de)翻(fan)譯(yi)起(qi)始密碼(ma)子的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質翻(fan)譯(yi)。核糖(tang)(tang)體結合位點可由目的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因自己帶入，也(ye)可利用載(zai)體預先裝(zhuang)載(zai)（一(yi)般要與ATG相(xiang)隔3～11 bp）。
①組成型表達 T7噬菌(jun)體啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)等屬于組成型啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)，在該類啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)的驅動(dong)(dong)下，外源(yuan)基因源(yuan)源(yuan)不斷地表(biao)選。組成型表(biao)達通常(chang)產(chan)量高，但不適合表(biao)達一些對宿主細胞有害(hai)的蛋白。
②誘導型表達 lac及其衍(yan)生tac啟動子都是IPTG誘(you)(you)導型(xing)啟動子，trp是色氨酸(suan)誘(you)(you)導型(xing)啟動子，IPL的(de)表(biao)達受溫度(du)調控(kong)。這(zhe)些(xie)誘(you)(you)導型(xing)啟動子的(de)可控(kong)性表(biao)達，既可避免表(biao)達產(chan)物(wu)對宿(su)主(zhu)前期生長的(de)不(bu)利影響，又可減少(shao)基因表(biao)達產(chan)物(wu)遭受蛋(dan)白酶的(de)降解作(zuo)用，特(te)別(bie)適合(he)有毒蛋(dan)自(zi)的(de)表(biao)達。
③融合型表達 表(biao)達載體的(de)(de)多克隆位點上(shang)有一段融合表(biao)達標簽(qian)（tag），表(biao)達為(wei)融合蛋(dan)白（N端融合或C端融合），可方便后續(xu)的(de)(de)蛋(dan)白分離(li)純化或檢測。常(chang)見的(de)(de)融合表(biao)達標簽(qian)有谷胱甘肽S轉移(yi)酶基因（GST）標簽(qian)或6×His標簽(qian)。對于特別小的(de)(de)目的(de)(de)蛋(dan)自，使用(yong)分子質量(liang)較大(da)的(de)(de)GST標簽(qian)為(wei)好。
④分泌型表達 在(zai)起(qi)始密碼和目(mu)的(de)(de)(de)基(ji)因之間加入一個信號(hao)肽，可(ke)以引導目(mu)的(de)(de)(de)蛋白穿越細(xi)(xi)胞(bao)膜。可(ke)避免表(biao)達(da)產物在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)過(guo)度積累而影響細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)生(sheng)長，或(huo)者形成包含體，而且表(biao)達(da)產物是可(ke)溶性(xing)的(de)(de)(de)，不(bu)需要復性(xing)。
由(you)于原核(he)生(sheng)(sheng)物(wu)和真(zhen)核(he)生(sheng)(sheng)物(wu)存在糖基(ji)化(hua)、酰基(ji)化(hua)等翻譯后修飾反應機制的(de)差異，真(zhen)核(he)基(ji)因的(de)原核(he)表達難(nan)以(yi)獲得有活性(xing)的(de)蛋(dan)白，酵(jiao)母(mu)成為了真(zhen)核(he)表達的(de)首(shou)選系(xi)統。
酵(jiao)母表達載體多(duo)數從pBR322基本骨(gu)架衍生而來，含有該(gai)質粒復制(zhi)起始位(wei)點（ori），lacZ基因(yin)、bla或ampr、tetr等基因(yin)。啟(qi)動(dong)子有GAP，AOX1、AUG1和(he)(he)GAL1等.其(qi)中，GAP是組成型(xing)啟(qi)動(dong)子，AOX1，AUG1和(he)(he)GAL1分(fen)別受(shou)甲醇、半乳糖和(he)(he)維生素(su)B1等誘導(dao)(dao)表達的誘導(dao)(dao)型(xing)啟(qi)動(dong)子。
酵母(mu)表達載體多為(wei)穿梭載體，既可(ke)以在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA進行體外操作，又可(ke)以在酵母(mu)中復制、表達和選擇。
Ti質(zhi)粒(li)（tumor inducing plasmid）是根據農桿(gan)菌中發現的(de)可引發植物(wu)產生(sheng)冠癭瘤的(de)質(zhi)粒(li)。Ti質(zhi)粒(li)可分為T-DNA、Vir、Con 和Ori 4個功能區(qu)。
利(li)用T-DNA可攜帶外源DNA片段并整合到植物基因組的特性，經對天然Ti質粒的改(gai)造，用于(yu)構建植物遺(yi)傳轉化的表達載(zai)體(ti)，分為(wei)一元表達載(zai)體(ti)和(he)雙元表達載(zai)體(ti)等類型。
這類載體(ti)是由質粒作為基(ji)(ji)本骨架構建而成，帶有原核復制區、選(xuan)擇(ze)性(xing)標記基(ji)(ji)因(yin)、啟動(dong)子、polyA尾信號序(xu)列、動(dong)物(wu)細胞中的選(xuan)擇(ze)基(ji)(ji)因(yin)[neor、胸苷激(ji)酶基(ji)(ji)因(yin)（tk）、綠色(se)熒光蛋(dan)白基(ji)(ji)因(yin)（gfp）和腺(xian)嘌呤磷(lin)酸(suan)核糖轉移(yi)酶基(ji)(ji)因(yin)（aprt）]等(deng)有關元件。山羊乳腺(xian)特異(yi)性(xing)表(biao)達載體(ti)（pBC1）是典型的動(dong)物(wu)質粒表(biao)達載體(ti)。
病毒表達(da)載體(ti)是以(yi)病毒基因(yin)組(zu)序(xu)列為(wei)基礎，插入必要的(de)(de)表達(da)載體(ti)元件所構建成(cheng)的(de)(de)真核基因(yin)轉移工具(ju)。這些(xie)表達(da)載體(ti)元件有①源于病毒的(de)(de)啟動子(zi)和增強子(zi)；②病毒的(de)(de)復制子(zi)序(xu)列以(yi)及所需的(de)(de)反式(shi)作用(yong)因(yin)子(zi)編碼基因(yin)；③poly A加(jia)尾信號。
病毒表達(da)載體可(ke)用于∶①外源蛋(dan)白的(de)真核(he)表達(da)；②基因治療；③多價、多聯活載體疫(yi)苗的(de)研制；④基因功能的(de)鑒定
重組型病毒載體
以完整的(de)病(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)為改造對象，一(yi)(yi)方面(mian)選擇(ze)性(xing)地刪(shan)除病(bing)毒(du)(du)的(de)某些必需(xu)(xu)基(ji)因(yin)(yin)，缺失的(de)必需(xu)(xu)基(ji)因(yin)(yin)的(de)功能(neng)由互補(bu)細胞反式提供；另一(yi)(yi)方面(mian)用外源基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達單(dan)位(wei)(wei)替代病(bing)毒(du)(du)非必需(xu)(xu)基(ji)因(yin)(yin)區；而病(bing)毒(du)(du)復制和(he)包裝所需(xu)(xu)的(de)順式作用元件不(bu)變。這(zhe)類載體一(yi)(yi)般通過(guo)同源重組(zu)方法將外源基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達單(dan)位(wei)(wei)插入病(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)中(zhong)。
無病毒基因的病毒載體
這(zhe)類載體(ti)系(xi)統(tong)(tong)(tong)往(wang)往(wang)由載體(ti)質粒(li)(li)和(he)(he)輔(fu)助(zhu)(zhu)系(xi)統(tong)(tong)(tong)組(zu)(zu)成(cheng)。重組(zu)(zu)載體(ti)質粒(li)(li)主要(yao)由外(wai)源(yuan)基(ji)因表達盒、病毒(du)復(fu)制和(he)(he)包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)所(suo)必需(xu)的(de)順式作(zuo)用(yong)元(yuan)件及質粒(li)(li)骨架(jia)組(zu)(zu)成(cheng)。輔(fu)助(zhu)(zhu)系(xi)統(tong)(tong)(tong)包(bao)(bao)(bao)括病毒(du)復(fu)制和(he)(he)包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)所(suo)必需(xu)的(de)所(suo)有(you)反式作(zuo)用(yong)元(yuan)件。在輔(fu)助(zhu)(zhu)系(xi)統(tong)(tong)(tong)的(de)作(zuo)用(yong)下，重組(zu)(zu)載體(ti)質粒(li)(li)（包(bao)(bao)(bao)含或(huo)不(bu)包(bao)(bao)(bao)含質粒(li)(li)骨架(jia)）以特(te)定形(xing)式（單鏈或(huo)雙鏈，DNA或(huo) RNA）被包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)到病毒(du)殼(ke)粒(li)(li)中，其(qi)中不(bu)含有(you)任何病毒(du)基(ji)因。
這類載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)的(de)優點在于(yu)(yu)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)病毒(du)本身安全性好，容量大；缺點在于(yu)(yu)往往需要輔(fu)助病毒(du)參(can)與(yu)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)DNA的(de)包裝，而(er)輔(fu)助病毒(du)又難以(yi)同載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)病毒(du)分離開來，造成最終產品中輔(fu)助病毒(du)污染，從而(er)影響(xiang)其(qi)應用。實際上(shang)，無病毒(du)基因(yin)的(de)病毒(du)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)可以(yi)看作是(shi)重組病毒(du)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)的(de)一(yi)種極端(duan)減毒(du)情況。重組AAV 載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)就屬于(yu)(yu)無病毒(du)基因(yin)的(de)病毒(du)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)。
腺病毒是一(yi)種(zhong)無包(bao)膜的(de)雙鏈DNA病毒，在(zai)自然界中廣泛分(fen)布。完整(zheng)的(de)病毒顆粒為(wei)二十面體對稱(cheng)結構，直徑70-100nm，衣(yi)殼含有(you)240個六鄰體（hexon）、12個五鄰體（penton）、12根纖毛（fiber）及(ji)一(yi)些小(xiao)蛋白等。哺乳動(dong)物腺病毒的(de)基因(yin)(yin)組(zu)DNA長約(yue)36kb，基因(yin)(yin)組(zu)的(de)兩(liang)端(duan)各有(you)約(yue)100bp的(de)反向(xiang)末端(duan)重復序(xu)列（ITR），ITR與(yu)末端(duan)蛋白（TP）相結合，與(yu)基因(yin)(yin)組(zu)復制及(ji)早期(qi)基因(yin)(yin)的(de)轉錄有(you)關，ITR的(de)內側為(wei)病毒包(bao)裝信號Ψ，參與(yu)腺病毒基因(yin)(yin)組(zu)的(de)衣(yi)殼化。
基(ji)(ji)(ji)(ji)于人(ren)血(xue)清(qing)5型腺(xian)病毒(du)(du)的(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組結構(gou)，結合(he)各基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)功能，科學家(jia)們開(kai)發了缺失E1和(he)E3基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)Ad5腺(xian)病毒(du)(du)載體(ti)。E1基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在組裝(zhuang)感染(ran)性病毒(du)(du)顆粒時必不可少，但是可以在HEK293包裝(zhuang)細胞中得(de)到補(bu)充，而(er)E3基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)不影(ying)病毒(du)(du)的(de)包裝(zhuang)。由于E1和(he)E3基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)缺失，腺(xian)病毒(du)(du)載體(ti)可插入(ru)高達7.5kb的(de)外源基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。
腺病毒感染細胞的原理
腺病毒(du)通過(guo)其纖(xian)毛蛋白(bai)C端的球(qiu)狀(zhuang)結(jie)構域與細胞(bao)表(biao)面(mian)(mian)特(te)異(yi)(yi)性(xing)受(shou)體（Ad5腺病毒(du)特(te)異(yi)(yi)性(xing)識別細胞(bao)表(biao)面(mian)(mian)的CAR受(shou)體；Ad5/F35腺病毒(du)能(neng)特(te)異(yi)(yi)性(xing)識別細胞(bao)表(biao)面(mian)(mian)的CD46受(shou)體）結(jie)合(he)，同時病毒(du)的五鄰體蛋白(bai)與細胞(bao)表(biao)面(mian)(mian)的整聯(lian)蛋白(bai)αvβ3和αvβ5相互作(zuo)用，通過(guo)細胞(bao)內吞完成病毒(du)的內化。
關于E1與E3基因
E1基因是(shi)一種(zhong)早(zao)期最先啟動的基因，對于腺病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)其他早(zao)期基因的轉錄是(shi)必需的，因此缺失(shi)E1的腺病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)載體不(bu)能有效復制和產生各種(zhong)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)蛋(dan)白，從而不(bu)能完成病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)生活周期。腺病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的E3區(qu)編(bian)碼5-9個蛋(dan)白，主要(yao)功(gong)能都是(shi)幫助受染細胞逃逸機體免疫系統的識別(bie)和清除。
Ad5與Ad5/F35對比
Ad5腺病(bing)毒的高效感染依賴于靶細(xi)胞(bao)膜上的CAR和αvβ整合(he)素，但是一些(xie)免疫(yi)細(xi)胞(bao)的細(xi)胞(bao)膜上卻缺乏這(zhe)些(xie)受體，如造(zao)血干細(xi)胞(bao)。這(zhe)就使(shi)得研究(jiu)人員尋找新的腺病(bing)毒血清型(xing)，最終發現F35血清型(xing)對造(zao)血干細(xi)胞(bao)有很強的靶向性，因此，嵌合(he)型(xing)Ad5/F35應用而生。下(xia)面是Ad5 & Ad5/F35的結構示意(yi)圖(tu)和區別：
| 腺病毒種類 | 載體特點 | 功能 | 感染細胞受體 | 包裝系統 |
|---|---|---|---|---|
| AdV5 | 缺失E1和E3基因，允許插入長約8kb的外源基因 |
除(chu)免疫、血液(ye)類細胞外， 感(gan)染大部分細胞 |
CAR | AdMax |
| AdV5/F35 |
一個嵌合(he)型(xing)腺(xian)病毒載體(ti)，主要結構是在AdV5的(de)(de)基(ji)礎上(shang)，其(qi)(qi)受體(ti)結合(he)位置(zhi)的(de)(de)纖突(Fiber)改(gai)造成(cheng)了F35型(xing)腺(xian)病毒(F35)的(de)(de)纖突(纖毛(mao)蛋白的(de)(de)Knob和shaft)。其(qi)(qi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)受體(ti)從AdV5的(de)(de)CAR變成(cheng)了CD46，其(qi)(qi)他的(de)(de)基(ji)因仍(reng)舊保留AdV5載體(ti)的(de)(de)特(te)性(xing)，能(neng)有(you)效(xiao)轉導CAR表達不足(zu)的(de)(de)多種重要靶細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)，尤其(qi)(qi)是對(dui)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)及造型(xing)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、間充(chong)質干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)等有(you)較高的(de)(de)感染效(xiao)率(lv)。 |
理論(lun)上感染所有(you)有(you)細(xi)(xi)胞核(he)的(de)細(xi)(xi)胞 |
CD46 | AdMax |
腺相關病(bing)毒(du)(du)（Adeno-associated virus，AAV）是一種單(dan)鏈(lian)DNA復(fu)(fu)制(zhi)缺陷型細(xi)小(xiao)(xiao)病(bing)毒(du)(du)，它(ta)的(de)(de)生(sheng)命周期(qi)依賴于復(fu)(fu)制(zhi)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)參(can)與。AAV基(ji)(ji)(ji)因組(zu)大(da)小(xiao)(xiao)為4.7 kb，由末端反(fan)向重(zhong)復(fu)(fu)序列ITR和(he)(he)中間的(de)(de)rep、cap基(ji)(ji)(ji)因組(zu)成。ITRs對于病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)復(fu)(fu)制(zhi)和(he)(he)包裝(zhuang)(zhuang)具有重(zhong)要作用；rep基(ji)(ji)(ji)因編碼參(can)與病(bing)毒(du)(du)復(fu)(fu)制(zhi)、包裝(zhuang)(zhuang)和(he)(he)基(ji)(ji)(ji)因組(zu)整(zheng)合的(de)(de)非(fei)結構蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)，cap基(ji)(ji)(ji)因編碼結構蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)VP1、VP2和(he)(he)VP3，3種蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)分別按(an)1:1:10的(de)(de)比例(li)組(zu)裝(zhuang)(zhuang)形(xing)成病(bing)毒(du)(du)衣(yi)殼，充當(dang)病(bing)毒(du)(du)基(ji)(ji)(ji)因傳遞(di)載(zai)體。此(ci)外(wai)，cap基(ji)(ji)(ji)因內嵌套的(de)(de)另(ling)一個開放閱(yue)讀框編碼裝(zhuang)(zhuang)配(pei)激活蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)AAP，參(can)與衣(yi)殼蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)靶向和(he)(he)裝(zhuang)(zhuang)配(pei)。
AAV轉導(dao)細(xi)胞(bao)(bao)主要經歷了細(xi)胞(bao)(bao)表面受體(ti)介導(dao)的內(nei)吞、逃離內(nei)體(ti)、入核、脫衣(yi)殼和雙鏈轉化(hua)幾(ji)個過程(cheng)。進入細(xi)胞(bao)(bao)后，可以(yi)在輔助病(bing)毒的存在下進入其復制周(zhou)期。
重組AAV載體(ti)(ti)可(ke)以通(tong)(tong)過將內(nei)源性的(de)(de)(de)(de)rep和(he)cap基(ji)因(yin)替(ti)換為一個(ge)表達(da)盒，該表達(da)盒由一個(ge)啟動(dong)子驅動(dong)一個(ge)感興(xing)趣的(de)(de)(de)(de)轉基(ji)因(yin)和(he)一個(ge)poly（A）尾(wei)巴(ba)組成。通(tong)(tong)過包(bao)(bao)裝質粒(li)(li)反式提供rep和(he)cap基(ji)因(yin)以及腺病毒輔助質粒(li)(li)來包(bao)(bao)裝載體(ti)(ti)。病毒編碼序(xu)列的(de)(de)(de)(de)完全去除使(shi)AAV的(de)(de)(de)(de)包(bao)(bao)裝能(neng)力最大化(hua)（包(bao)(bao)裝容量為4.5Kb），并且有助于它(ta)們(men)在體(ti)(ti)內(nei)遞送時的(de)(de)(de)(de)低(di)免疫原性和(he)細胞毒性。
基(ji)(ji)因(yin)工程化的AAV能轉導外(wai)源基(ji)(ji)因(yin)，借助特定啟動子、光遺(yi)傳(chuan)學(xue)(xue)/化學(xue)(xue)遺(yi)傳(chuan)學(xue)(xue)元件(jian)、鈣指示劑(ji)、神經(jing)遞(di)質探針或Cre/lox P，Flp／FRT重組酶技術，可選擇性地(di)標記(ji)特定的神經(jing)元。重組AAV基(ji)(ji)因(yin)傳(chuan)遞(di)效果好、缺乏致病性和安全性高、宿主細胞(bao)范圍廣、在體(ti)內表(biao)達(da)時間長，是目前(qian)最有前(qian)途和最成功的基(ji)(ji)因(yin)治療(liao)載體(ti)之一。
現(xian)(xian)階段研究(jiu)人(ren)員(yuan)已(yi)發現(xian)(xian)12種人(ren)類AAV 血(xue)清(qing)(qing)型(xing)（AAV1至AAV12）和(he) 100多種非人(ren)類靈長(chang)動物AAV血(xue)清(qing)(qing)型(xing)。不(bu)(bu)同(tong)AAV血(xue)清(qing)(qing)型(xing)具有不(bu)(bu)同(tong)的(de)衣殼蛋白空間結構、序列(lie)和(he)組織特異性(xing)，因而其(qi)識別與結合的(de)細胞(bao)表(biao)面受體也(ye)(ye)相應有很(hen)大差別，這也(ye)(ye)導致不(bu)(bu)同(tong)血(xue)清(qing)(qing)型(xing)轉染的(de)組織類型(xing)、細胞(bao)類型(xing)和(he)感染效率也(ye)(ye)各(ge)不(bu)(bu)相同(tong)。
已批準用(yong)于商業用(yong)途的：AAV1和AAV2；
臨(lin)床使(shi)用頻率最高的：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；
AAV8，AAV9：靶向全身(shen)的多種肌肉類型；
幾乎所有(you)天然(ran)AAV衣殼都可以在全身給藥(yao)后有(you)效地轉到肝臟(zang)；
| Serotype | Glycan recognitiona | Coreceptor |
|---|---|---|
| AAV1 | Neu5Aca2-3GalNAcβ1-4GlcNAc | Unknown |
| AAV2 | 6-O-and N-sulfated heparin |
Fibroblast / hepatocyte growth factor receptor; laminin receptor; integrin αVβ5 and α5β1 |
| AAV3 | 2-O-and N-sulfated heparin | Hepatocyte growth factor receptor; Laminin receptor |
| AAV4 | Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc | Unknown |
| AAV5 | Neu5Acα2-3(6S)Galβ1-4GlcNAc | Platelet-derived growth factor receptor |
| AAV6 | Neu5Acα2-3GalNAcβ1-4GlcNAc; N-sulfated heparin | Epidermal growth factor recepto |
| AAV7 | Unknown | Unknown |
| AAV8 | Unknown | Laminin receptor |
| AAV9 | Galactose | Laminin receptor |
| Tissue | Optimal Serotype |
|---|---|
| CNS | AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8，AAV9 |
| Heart |
AAV1，AAV8，AAV9 |
| Kidney | AAV2 |
| Liver | AAV7，AAV8，AAV9 |
| Lung | AAV4，AAV5，AAV6，AAV9 |
| Pancreas | AAV8 |
| Photoreceptor Cells | AAV2，AAV5，AAV8 |
| RPE(Retinal Pigment Epithelium) | AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8 |
| Skeletal Muscle | AAV1，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9 |
1. 局(ju)部注(zhu)射，直接(jie)在想表(biao)達的地方注(zhu)射 rAAV ，適合器官水平特異感染，容易操作。
2. 使用組織/器官(guan)特(te)異(yi)啟動子(zi)來表達(da)外(wai)源基因包裝 rAAV， rAAV 即使感染了其他(ta)組織也由于特(te)異(yi)性啟動子(zi)而不會在其他(ta)組織中表達(da)。
3.Cre-on，Flex，DIO，double floxed :使用 Cre-Loxp 系統，經(jing)過兩次(ci)染色(se)體重組在特定(ding)臟器中表達外源(yuan)基(ji)因。
目(mu)前(qian)，研究人員常用(yong)的兩(liang)類AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是(shi)基(ji)(ji)于2個基(ji)(ji)礎(chu)被開發的：一(yi)個是(shi)理(li)論基(ji)(ji)礎(chu)：無(wu)論scAAV還是(shi)rAAV，病(bing)毒顆(ke)粒中均可包裹二倍體(ti)，甚至四倍體(ti)的AAV基(ji)(ji)因(yin)組DNA；一(yi)個是(shi)結構(gou)基(ji)(ji)礎(chu)：wtAAV ITR序列的特殊性(T型結構(gou))。ssAAV包裝(zhuang)基(ji)(ji)因(yin)組正義鏈和反(fan)義鏈的幾率一(yi)樣。ssAAV在入核(he)、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚(ju)合酶(mei)或者分子(zi)間退火完成雙鏈轉(zhuan)(zhuan)化，才能(neng)啟(qi)動基(ji)(ji)因(yin)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)過程，而scAAV中已存在雙鏈，它入核(he)后即可啟(qi)動基(ji)(ji)因(yin)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)，跨過了雙鏈轉(zhuan)(zhuan)化的步驟，從而實現外源(yuan)基(ji)(ji)因(yin)的快(kuai)速表達。
ssAAV和scAAV向(xiang)靶(ba)細胞(bao)中遞送外源基(ji)因的過程(cheng)：
慢病(bing)毒(du)(du)屬(shu)于(yu)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)(du)科，能夠感(gan)染分裂和非分裂的(de)(de)細胞，從而將(jiang)它們(men)與(yu)普通(tong)的(de)(de)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)(du)區別開來。慢病(bing)毒(du)(du)基因組(zu)(zu)由兩個拷貝的(de)(de)單鏈RNA組(zu)(zu)成(cheng)，并(bing)被結(jie)構蛋白(bai)和酶蛋白(bai)包裹在衣殼中(zhong)，這些結(jie)構蛋白(bai)和酶蛋白(bai)包括逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶（將(jiang)RNA轉(zhuan)化為(wei)dsDNA）和DNA整合酶（將(jiang)dsDNA整合到宿主基因組(zu)(zu)中(zhong)）。
如上圖步驟(zou)｜，用包(bao)膜、轉(zhuan)移(yi)和包(bao)裝載(zai)體(ti)轉(zhuan)染慢(man)病(bing)毒(du)包(bao)裝細(xi)胞(bao)(bao)系。包(bao)膜、轉(zhuan)移(yi)和包(bao)裝載(zai)體(ti)轉(zhuan)錄的mRNA分別(bie)被翻譯成(cheng)(cheng)：通過內質(zhi)網進入細(xi)胞(bao)(bao)膜的病(bing)毒(du)包(bao)膜蛋白（2a）；單鏈RNA病(bing)毒(du)基因組（2b）；病(bing)毒(du)結構(gou)蛋白和酶（2c），這三(san)種成(cheng)(cheng)分組裝成(cheng)(cheng)病(bing)毒(du)顆粒(li)，從宿主細(xi)胞(bao)(bao)膜上出芽(ya)。
如上(shang)(shang)圖步驟(zou)‖，病(bing)毒(du)顆粒通過包膜(mo)(mo)蛋(dan)白附著在宿(su)主細胞表面受體上(shang)(shang)，病(bing)毒(du)與(yu)宿(su)主質膜(mo)(mo)融合(he)釋放結構蛋(dan)白、酶(mei)蛋(dan)白和病(bing)毒(du)基(ji)因組(zu)。病(bing)毒(du)RNA被(bei)逆轉錄成雙鏈(lian)DNA，并與(yu)整(zheng)合(he)酶(mei)形(xing)成預整(zheng)合(he)復合(he)物，整(zheng)合(he)酶(mei)通過核孔復合(he)物，催化病(bing)毒(du)DNA整(zheng)合(he)到宿(su)主基(ji)因組(zu)中，最后轉移載(zai)體啟動子驅動轉基(ji)因表達(da)。
人(ren)類免疫(yi)缺(que)陷病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)-1型(xing)（HIV-1）作為(wei)典型(xing)的(de)慢病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)，其(qi)基因Gag、Pol和(he)Env分別(bie)編碼結構核心蛋白、逆轉錄酶和(he)整合酶以(yi)及(ji)包膜糖蛋白；Tat和(he)Rev參(can)與病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)復(fu)制：Tat啟動(dong)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)基因組(zu)轉錄，并受長(chang)末端(duan)重復(fu)序列驅動(dong)，Rev促進病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)mRNA的(de)核輸出，并受到(dao)Rev響(xiang)應元件的(de)調(diao)控；包裝信(xin)號(Ψ)是(shi)將病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)基因組(zu)進入(ru)衣殼(ke)的(de)關鍵。此外，HIV-1基因組(zu)中(zhong)包含的(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)力因子Vif、Vpr、Vpu和(he)Nef會干擾宿主防御機制，并包含在組(zu)裝好的(de)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)粒子中(zhong)。（圖2）
慢病毒是以HIV-1為基礎發展起來的基因治療載體。
第一代(dai)慢病毒載體將所有(you)包裝元件編(bian)碼(ma)在一個載體上，生物(wu)安全(quan)風險較高；
第二代慢病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)載體去除(chu)了毒(du)(du)(du)力因子并將包膜從(cong)包裝載體中分(fen)離(li)，提高(gao)了安全性并增強(qiang)了病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)復制(zhi)，而不(bu)干擾(rao)有(you)功能(neng)的病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)粒子的生產。此外，3’LTR包含U3缺失，可以消除(chu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)基因組復制(zhi)的啟動子活性，并在不(bu)影響病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)粒子滴度或轉(zhuan)基因表(biao)達的情況下自滅活載體。
第三(san)代慢(man)病(bing)毒載(zai)體從包裝(zhuang)載(zai)體中去除Rev，并(bing)用(yong)轉(zhuan)移載(zai)體上游的一(yi)個組成啟(qi)動子替換Tat，是(shi)目前被廣泛應用(yong)的慢(man)病(bing)毒包裝(zhuang)載(zai)體。（圖(tu)3）
引物是(shi)指在PCR反應中與待擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)的(de)(de)靶(ba)DNA區(qu)段兩(liang)翼互補(bu)的(de)(de)寡聚核苷(gan)酸，其本質是(shi)單鏈 DNA片(pian)段。PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)產物的(de)(de)大(da)小及擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)的(de)(de)靶(ba)序列在基因組中的(de)(de)位置是(shi)由引物限定的(de)(de)，因此，引物的(de)(de)選擇對PCR 成功與否具有決定性(xing)意義。引物設計質量是(shi)影響PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)成敗的(de)(de)關鍵因素(su)，一般(ban)要(yao)考慮以下(xia)幾個問題：
① 引(yin)(yin)物(wu)長(chang)(chang)度一(yi)般(ban)16~30 bp為宜、20~24 bp為佳。引(yin)(yin)物(wu)長(chang)(chang)度較短一(yi)般(ban)會(hui)降低擴(kuo)增(zeng)特異性(xing)，但會(hui)提(ti)高(gao)有(you)效性(xing)，擴(kuo)增(zeng)的產物(wu)種類會(hui)增(zeng)多。
② G+C含(han)量(liang)一般為40%~60%為佳，兩條引物G+C含(han)量(liang)應盡量(liang)相似，Tm最好接近，差異最好在1℃以內(nei)，最多(duo)不超過5℃。
③ 兩個(ge)引(yin)物之間不應(ying)發(fa)生互補，特(te)別應(ying)避(bi)免形成(cheng)"引(yin)物二聚(ju)體"，如果無(wu)法避(bi)免，其3'端互補不應(ying)大于(yu)2個(ge)堿(jian)基(ji)，應(ying)盡量避(bi)免數個(ge)嘌(piao)呤(ling)或嘧啶連續排列(lie)，避(bi)免同(tong)(tong)源序列(lie)（尤其 6個(ge)堿(jian)基(ji)以上相同(tong)(tong)）。
④ 引物內(nei)部避免形成次(ci)級結(jie)(jie)構(gou)，尤其發卡結(jie)(jie)構(gou)，若(ruo)用(yong)人(ren)工判(pan)斷，引物自身連續(xu)互補堿基(ji)不能(neng)大于3bp，必要時應通過計(ji)算機進(jin)行結(jie)(jie)構(gou)分析(xi)。
⑤ 引物的延(yan)伸從(cong)3'端開始，3'端不(bu)能進行任何修飾，也不(bu)能有(you)形(xing)成(cheng)任何二級結構(gou)的可能，3'末端最后1個堿基(ji)最好是G或C。
⑥ 引(yin)物的5'端(duan)限定著PCR產物的長(chang)度，對擴增(zeng)特(te)異(yi)(yi)性影響不(bu)大，因此，5'端(duan)可以被修飾而(er)不(bu)影響擴增(zeng)的特(te)異(yi)(yi)性。
⑦ 引物3'端不(bu)要終止于編(bian)碼區(qu)城密(mi)碼子的第3位，因密(mi)碼子的第3位易(yi)發生簡并，會影響擴增特異性與效率(lv)。
引物(wu)設計(ji)(ji)可借助于一些計(ji)(ji)算機引物(wu)設計(ji)(ji)軟件(jian)方(fang)便(bian)地進行。目前用于引物(wu)設計(ji)(ji)的欽(qin)件(jian)有多種，其中Oligo6、Prmer5.0是非常方(fang)便(bian)且功能強大的引物(wu)設計(ji)(ji)分(fen)析軟件(jian)。
聚合酶(mei)鏈式(shi)反應(ying)(ying)（polymerase chain reaction，PCR）是 Kary M u l l i s 于(yu)1985年發(fa)(fa)明的(de)(de)核酸體外擴增(zeng)技(ji)術(shu)(shu)，是分子(zi)克隆研究中不可或缺(que)的(de)(de)基(ji)(ji)本技(ji)術(shu)(shu)。隨著(zhu)分子(zi)生(sheng)物學的(de)(de)發(fa)(fa)展，人們在PCR基(ji)(ji)本技(ji)術(shu)(shu)的(de)(de)基(ji)(ji)礎上(shang)，不斷地推陳(chen)出新，發(fa)(fa)展了(le)多種PCR延伸技(ji)術(shu)(shu)（反轉錄PCR、錨定PCR、巢式(shi) PCR、實時定量PCR等等），以適應(ying)(ying)不同(tong)的(de)(de)用(yong)途。
在有DNA單(dan)(dan)鏈(lian)(lian)、與(yu)DNA單(dan)(dan)鏈(lian)(lian)互(hu)補(bu)的(de)(de)寡核苷酸引物(wu)、dNTPs及DNA聚合(he)酶的(de)(de)情(qing)況(kuang)下(xia)，引物(wu)與(yu)單(dan)(dan)鏈(lian)(lian)的(de)(de)互(hu)補(bu)區結(jie)合(he)后，在DNA聚合(he)酶的(de)(de)催化作用(yong)下(xia)即可(ke)進(jin)行DNA單(dan)(dan)鏈(lian)(lian)的(de)(de)5'→3'合(he)成(cheng)反(fan)(fan)應。通過(guo)特殊的(de)(de)儀(yi)器不斷滿足上述條件(jian)，則(ze)DNA單(dan)(dan)鏈(lian)(lian)的(de)(de)5'→3'合(he)成(cheng)反(fan)(fan)應可(ke)不斷進(jin)行下(xia)去(qu)，直到條件(jian)不復存在，實質上是模擬天然(ran)DNA的(de)(de)復制(zhi)過(guo)程(cheng)。
PCR包(bao)括三個基本過程：變(bian)性(xing)、退火和(he)延(yan)伸。
①變(bian)性(xing)（denaturation）：92~96℃的(de)高溫處理可使模(mo)板(ban)DNA雙鏈間(jian)(jian)氫鍵斷裂，解離成(cheng)單(dan)鏈但不改變(bian)其化學性(xing)質，變(bian)性(xing)的(de)時間(jian)(jian)一般為30 s，如果模(mo)板(ban)的(de)G+C含量較高，變(bian)性(xing)時間(jian)(jian)可適當延長。
②退(tui)火(huo)（annealing）：將溫(wen)度(du)降(jiang)低(di)(di)到55℃左右(you)，使引(yin)物與(yu)模(mo)板(ban)的(de)(de)(de)(de)互補區結合。退(tui)火(huo)的(de)(de)(de)(de)溫(wen)度(du)取決于引(yin)物的(de)(de)(de)(de)Tm值，并通(tong)過預備試驗最終確(que)定(ding)。一(yi)般(ban)引(yin)物越(yue)短，其Tm值也(ye)越(yue)低(di)(di)，反之則高(gao)。退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)越(yue)高(gao)，引(yin)物與(yu)模(mo)板(ban)結合的(de)(de)(de)(de)特異性(xing)(xing)增強，非特異性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)擴增概(gai)(gai)率(lv)(lv)降(jiang)低(di)(di)，但擴增效率(lv)(lv)也(ye)隨之降(jiang)低(di)(di)。相反，隨著溫(wen)度(du)的(de)(de)(de)(de)降(jiang)低(di)(di)，引(yin)物與(yu)模(mo)板(ban)的(de)(de)(de)(de)非特異性(xing)(xing)結合的(de)(de)(de)(de)概(gai)(gai)率(lv)(lv)提高(gao)。退(tui)火(huo)的(de)(de)(de)(de)時間一(yi)般(ban)為30s。
③延(yan)伸(shen)(shen)（extension）：在72℃溫(wen)度下，DNA聚合(he)酶(mei)將dNTPs連(lian)續加到引物的(de)3'-OH端，以(yi)互(hu)補(bu)的(de)DNA單鏈為模板，沿著模板延(yan)伸(shen)(shen)合(he)成模板 DNA的(de)互(hu)補(bu)鏈，稱為延(yan)伸(shen)(shen)。延(yan)伸(shen)(shen)的(de)時間(jian)由擴增產物的(de)大小決(jue)定，一般每1kb延(yan)伸(shen)(shen)1min。
這(zhe)三個過程組成一個循環(huan)周期(qi)，每個周期(qi)合成的產物又可作為下一個周期(qi)的模(mo)板，如此循環(huan)往復，經過n輪循環(huan)后，靶DNA的拷貝數理論上呈(cheng)2n增(zeng)長。
PCR反(fan)應(ying)經過一定數量(liang)的循環后，隨(sui)著產物的對數累(lei)積趨于飽(bao)和(he)，DNA片(pian)段不再呈指數積累(lei)，而是(shi)進入線性增(zeng)長期或靜止期，此過程稱為平臺效應(ying)（plateau effect）。
平臺期與(yu)下列因素有(you)關(guan)：①隨著(zhu)引物(wu)、dNTP 快速摻入底物(wu)中，它(ta)們的(de)濃度(du)降低，摻入速度(du)減慢；②隨產(chan)物(wu)增(zeng)加(jia)，酶(mei)與(yu)模板(ban)的(de)比(bi)例下降；③非特異性產(chan)物(wu)或引物(wu)二(er)聚體與(yu)反(fan)應物(wu)的(de)競爭；④產(chan)物(wu)的(de)再結合。
PCR反應需要(yao)一定的(de)條件(jian)才能完成，這些條件(jian)主要(yao)有(you)以下方面：
（一）緩沖液
任何一個生化反(fan)應都(dou)必須(xu)在一定的(de)(de)緩(huan)(huan)沖(chong)體(ti)(ti)系(xi)中(zhong)進行(xing)，緩(huan)(huan)沖(chong)體(ti)(ti)系(xi)除了提供一定的(de)(de)pH緩(huan)(huan)沖(chong)能(neng)力(li)外，還有(you)一些有(you)助(zhu)于反(fan)應進行(xing)的(de)(de)成分(fen)。PCR反(fan)應緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)通(tong)常采(cai)用(yong)(yong)10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室溫）緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)體(ti)(ti)系(xi)，其中(zhong)含(han)有(you)可激活(huo)(huo)DNA聚(ju)合(he)酶的(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)中(zhong)心的(de)(de)二價陽離子，一般采(cai)用(yong)(yong)Mg2+，以MgCl2的(de)(de)形(xing)式提供，Mg2+的(de)(de)濃度高(gao)低可顯著影(ying)響 PCR擴增產物(wu)的(de)(de)特(te)異性(xing)，此外，緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)還含(han)有(you)50 mmol/L的(de)(de)K+，有(you)利(li)于引物(wu)與(yu)模板的(de)(de)退火。有(you)些緩(huan)(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)還加(jia)入(ru)明(ming)膠或(huo)血清白(bai)蛋白(bai)（100 μg/mL）及去污劑(ji)（如Twcen20 等(deng)），對Taq DNA聚(ju)合(he)酶起穩(wen)定作用(yong)(yong)。
（二）模板
PCR模(mo)(mo)板(ban)是含有(you)待擴(kuo)(kuo)增(zeng)序列(lie)的(de)(de) DNA、mRNA或(huo)cDNA等，模(mo)(mo)板(ban)數量(liang)(liang)可(ke)直(zhi)接影響擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)(de)效果。對于一般的(de)(de) PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)，104～107個模(mo)(mo)板(ban)分子可(ke)達到滿(man)意的(de)(de)效果，一般宜用納克(ke)（ng）級的(de)(de)克(ke)隆DNA、微克(ke)（μg）水(shui)平的(de)(de)染(ran)色體DNA或(huo)102～105拷貝待擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)(de)DNA片段(duan)作為起(qi)始材料。除了數量(liang)(liang)外，模(mo)(mo)板(ban)的(de)(de)質量(liang)(liang)也非常重要，不能(neng)有(you)太多(duo)的(de)(de)蛋白質和其他污(wu)染(ran)，特(te)別(bie)是其他DNA的(de)(de)污(wu)染(ran)，即使是痕量(liang)(liang)的(de)(de)DNA，也會導致非特(te)異性產物。
（三）dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的(de)總(zong)稱。貯備液(ye)為pH 7.0 左右，其(qi)濃(nong)度(du)(du)一般為20 mmol，-20℃保存。體(ti)系中為20~200 μmol即可，過低則(ze)反應(ying)速度(du)(du)下降，濃(nong)度(du)(du)過高則(ze)特異性(xing)下降，因為dNTP能絡合溶液(ye)中的(de)Mg2+，產生錯(cuo)配(pei)或抑制Taq DNA聚合酶(mei)活性(xing)。
（四）耐熱的DNA聚合酶
PCR反應(ying)中使(shi)(shi)用(yong)的(de) DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)必須耐高溫，在90℃以(yi)上的(de)高溫下仍(reng)能有活性，正是由(you)于(yu)耐熱DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)的(de)應(ying)用(yong)才使(shi)(shi) PCR技術得以(yi)實(shi)現(xian)，目前使(shi)(shi)用(yong)的(de)耐高溫DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)主要有Taq DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)、Tth DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)、Vent DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)、Pfu DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)和Pwo DNA聚(ju)(ju)(ju)(ju)合(he)酶(mei)(mei)等。
（五）引物
根據大量的(de)(de)(de)研究(jiu)報道，PCR反(fan)應(ying)(ying)的(de)(de)(de)最佳條件為(wei)(wei)：①Taq DNA聚合酶的(de)(de)(de)濃度(du)(du)為(wei)(wei)1.0-2.5 U/100μL反(fan)應(ying)(ying)液；②dNTP的(de)(de)(de)濃度(du)(du)為(wei)(wei)20～200 μmol/L；③Mg2+濃度(du)(du)為(wei)(wei)0.5～2.5 mmol/L；④引物的(de)(de)(de)濃度(du)(du)為(wei)(wei)0.2～1.0 μmol/L。在(zai)準備具體的(de)(de)(de)PCR反(fan)應(ying)(ying)時，還要針對模板特性、PCR儀等進行上述反(fan)應(ying)(ying)體系的(de)(de)(de)優化(hua)，并設(she)置(zhi)試(shi)驗確定連退火溫度(du)(du)、延(yan)伸時間(jian)，建立其相(xiang)應(ying)(ying)的(de)(de)(de)PCR反(fan)應(ying)(ying)最優程序。
在(zai)PCR過程(cheng)中，研究人員通(tong)常會在(zai)PCR反應體系中添加二甲基亞砜DMSO，那么它究竟有什(shen)么作用呢(ni)？機理(li)是什(shen)么呢(ni)？
通常我們可以這么理解：DMSO主要用于高GC含量的模板擴增，可能的機理是改善GC含量高的DNA的變形情況，降低其二級結構，使得聚合酶在二級結構處延伸。DMSO可以提高PCR的特異性,幫助擴增一些難擴的模板。當(dang)體(ti)系中(zhong)加入DMSO時，可適當(dang)降低退(tui)火溫度。
延伸閱讀
在實踐中，聚合酶鏈式反應可能因各種原因而失敗，通常表現為兩個問題，一是目的模板的擴增量太少，二是非目的基因擴增太多。這種情況話，研究人員通常會在反應體系中加入合適的添加劑進行解決。通常添加劑的作用主要是降低基因的二級結構或者降低非特異性的啟動。下面是幾種常用的添加劑以及它們的作用：
① 二甲基(ji)亞砜DMSO、非離子性洗(xi)滌劑(ji)、甜菜堿——可以降低DNA二級結構
② 甲酰胺(an)、四甲基氯化銨(an)TMAC——降低非特(te)異性(xing)啟(qi)動
③ 鎂(mei)離子——聚合酶(mei)不(bu)可缺少的一個輔(fu)因子
④ 牛血清白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)——減少污染物
一般而言，常規PCR很難(nan)通過基(ji)因(yin)擴(kuo)增產物來(lai)定(ding)量該基(ji)因(yin)在(zai)模板中(zhong)的(de)表達，而實(shi)時定(ding)量PCR（real-time quantitative PCR）則可解(jie)決這一問題。所(suo)謂實(shi)時定(ding)量PCR技術，是指(zhi)在(zai)PCR反應(ying)體系中(zhong)加入熒(ying)光基(ji)團，利用熒(ying)光信號(hao)積累實(shi)時監測(ce)整(zheng)個PCR進(jin)程，最后通過標準曲(qu)線對模板中(zhong)特(te)定(ding)基(ji)因(yin)進(jin)行定(ding)量分析的(de)方法。
熒光擴增曲線可以分成三個階段∶熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；在平臺期，擴增產物已不再呈指數級增加，PCR產物量與起始模板量之間沒有線性關系，無法根據最終PCR產物量算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量(liang)的對數值與起始(shi)模板量(liang)之間存(cun)在線性關系(xi)，可以選擇在這(zhe)個階段進行定量(liang)分(fen)析。
①臨界點選擇。臨界點是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值。它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般將臨界點缺省設置為3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍；②臨界點循環數（threshold cycle，Tc或Ct），PCR反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數稱為臨界點循環數，模板的Ct值與模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小；③標準曲線繪制。利用已知起始拷貝(bei)數(shu)的標準(zhun)品(pin)可繪(hui)制標準(zhun)由線，其中橫坐標代表(biao)起始拷貝(bei)數(shu)的對數(shu)，縱坐標代表(biao)Ct值。因此(ci)，只要獲(huo)得未知樣(yang)品(pin)的Ct值，即可從標準(zhun)曲線上推算出(chu)該樣(yang)品(pin)的起始拷貝(bei)數(shu)。
探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)和非(fei)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)實時定(ding)量PCR的(de)(de)化學原理有所不同(tong)。探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)是利(li)用與靶序列(lie)特異(yi)雜交的(de)(de)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)來指示(shi)(shi)擴增(zeng)(zeng)產(chan)物(wu)(wu)的(de)(de)增(zeng)(zeng)加(jia)；非(fei)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)類(lei)則是利(li)用熒光(guang)染料或者(zhe)(zhe)特殊設計的(de)(de)引物(wu)(wu)來指示(shi)(shi)擴增(zeng)(zeng)產(chan)物(wu)(wu)的(de)(de)增(zeng)(zeng)加(jia)。前者(zhe)(zhe)由于增(zeng)(zeng)加(jia)了(le)探(tan)(tan)(tan)針(zhen)(zhen)的(de)(de)識別步驟，特異(yi)性更高，但(dan)后者(zhe)(zhe)則簡便易行(xing)。
①TaqMan熒(ying)(ying)(ying)(ying)光探(tan)針(zhen) PCR擴(kuo)增時在加入一(yi)對引物的(de)(de)同時，也加入一(yi)個(ge)(ge)特(te)異性(xing)寡核苷酸(suan)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光探(tan)針(zhen)，其兩端(duan)分(fen)別(bie)標記了(le)一(yi)個(ge)(ge)報(bao)告熒(ying)(ying)(ying)(ying)光基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)和一(yi)個(ge)(ge)淬滅熒(ying)(ying)(ying)(ying)光基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)。在探(tan)針(zhen)完整(zheng)的(de)(de)情況下，報(bao)告基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)發(fa)射的(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光信號會被淬滅基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)吸(xi)收；PCR擴(kuo)增時，Taq DNA酶的(de)(de)5'-3'核酸(suan)外切(qie)酶活性(xing)將探(tan)針(zhen)酶切(qie)降(jiang)解，使(shi)報(bao)告熒(ying)(ying)(ying)(ying)光基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)和淬滅熒(ying)(ying)(ying)(ying)光基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)分(fen)離，熒(ying)(ying)(ying)(ying)光監測系統可接(jie)收到熒(ying)(ying)(ying)(ying)光信號，即每(mei)擴(kuo)增一(yi)條(tiao)DNA鏈，就有一(yi)個(ge)(ge)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光分(fen)子形成，實現了(le)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光信號的(de)(de)累積(ji)與PCR產(chan)物形成完全(quan)同步。
②SYBR熒(ying)光(guang)染料 在PCR反應體(ti)系(xi)中(zhong)(zhong)，加(jia)入(ru)過量(liang)SYBR熒(ying)光(guang)染料，SYBR熒(ying)光(guang)染料特異性地摻入(ru)DNA 雙(shuang)鏈后，發射(she)熒(ying)光(guang)信號，而不摻入(ru)鏈中(zhong)(zhong)的(de)SYBR 染料分子不會發射(she)任何熒(ying)光(guang)信號，從而保證熒(ying)光(guang)信號的(de)增(zeng)加(jia)與PCR產物(wu)的(de)增(zeng)加(jia)完全同(tong)步。
實時熒光定量(liang)(liang)PCR技(ji)術是(shi)DNA定量(liang)(liang)技(ji)術的一次飛躍(yue)，運用該技(ji)術可(ke)進行(xing)基(ji)因(yin)表達、基(ji)因(yin)型(xing)鑒定、DNA或RNA的絕對(dui)定量(liang)(liang)等領域的分析。
