盤點神經研究中常用的AAV血清型

作為基因治療的(de)(de)首選(xuan)載體，腺(xian)相(xiang)關(guan)病毒（AAV）擁有(you)(you)許多的(de)(de)特點，特別是天然(ran)的(de)(de)AAV衣(yi)(yi)(yi)殼有(you)(you)成百(bai)上(shang)千種，這(zhe)也就(jiu)是文獻中常提到的(de)(de)AAV血清型。不同的(de)(de)衣(yi)(yi)(yi)殼蛋(dan)白(bai)（Cap）或AAV血清型提供(gong)了多樣性的(de)(de)組織侵染(ran)能力的(de)(de)選(xuan)擇(ze)，并且(qie)為避開基因治療宿(su)主(zhu)已有(you)(you)的(de)(de)對某(mou)些(xie)衣(yi)(yi)(yi)殼蛋(dan)白(bai)的(de)(de)免(mian)疫(yi)抗性提供(gong)了可能。

現階段(duan)研(yan)究人員已(yi)發現12種人類(lei)AAV血(xue)清型（AAV1至AAV12）和100多種非人類(lei)靈(ling)長動物AAV血(xue)清型，不(bu)同血(xue)清型的(de)(de)(de)AAV具有不(bu)同的(de)(de)(de)特性(xing)。圖1所列(lie)為(wei)人類(lei)AAV1至AAV9識(shi)別的(de)(de)(de)細胞表面(mian)受體，圖2所列(lie)為(wei)AAV1至AAV9的(de)(de)(de)不(bu)同組織親噬(shi)性(xing)。

圖1、人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體

圖2、AAV1至AAV9的不同組織親噬性

今天我們重點盤點一下，在神經研究中有哪些常用且好用的AAV血清型。

據報道，目前適用于神經系統的AAV血清型有：1、2、5、6、8、9、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、DJ、Retro、rh10等十幾(ji)種，不同的(de)血清(qing)(qing)型在神經系統不同部(bu)位的(de)感(gan)染效率(lv)及擴散能力不同，合適(shi)(shi)的(de)血清(qing)(qing)型關(guan)乎基(ji)因(yin)是否能夠實現高效穩定表(biao)達，甚(shen)至(zhi)(zhi)關(guan)乎最終(zhong)的(de)研究結果(guo)，因(yin)此(ci)綜(zong)合標(biao)記的(de)細胞和每種AAV血清(qing)(qing)型的(de)特性等因(yin)素來選擇合適(shi)(shi)的(de)AAV血清(qing)(qing)型至(zhi)(zhi)關(guan)重要。

那么，面對琳瑯滿目的血清型，該如何選擇適合自己的那個呢？

利用AAV實現對神經環路的精確標記，主要涉及兩大基本問題即方向性（順向、逆向）和是否跨突觸的問題。順向(Anterograde)是由注射部位的神經元胞體經軸突下行至末梢，逆向(Retrograde)是由軸突末梢傳到細胞體；順向跨突觸（Anterograde transneuronal）是從胞體傳到軸突末梢后跨過突觸傳遞至下一級神經元，逆向跨突觸（Retrograde transneuronal）跟順向(xiang)跨(kua)突觸相(xiang)反，是由胞體逆向(xiang)跨(kua)突觸傳遞(di)至上一級神經元的(de)軸突。如下圖所(suo)示(shi)：

圖3. AAV標記神經元的方式 （Strick P L et al. eLS, 2011）

可逆向示蹤的血清型

常見的AAV病毒載體都是順向標記，極少能進行逆行傳遞，這大大限制了AAV載體在神經環路示蹤中的應用。直到2016年，研究人員在AAV2的基礎上，通過定向進化的方式改造出一種具有逆向示蹤功能的AAV2突變體——AAV2-retro，該(gai)載(zai)體(ti)能夠(gou)在小鼠大腦中進行(xing)有效的神經環(huan)路逆(ni)(ni)向(xiang)標記(ji)，且其逆(ni)(ni)行(xing)示(shi)(shi)蹤(zong)能力和效率與傳(chuan)統(tong)的逆(ni)(ni)行(xing)示(shi)(shi)蹤(zong)劑相當。圖4所示(shi)(shi)為rAAV2-retro的開發過(guo)程及應用實例：

圖4、rAAV2-retro（逆向非跨突觸標記） （Tervo et al., Neuron, 2016）

可順向跨單級突觸的血清型

2017年張礪教授團隊研究報道AAV1能(neng)在(zai)高滴度條件下呈順(shun)向(xiang)(xiang)(xiang)跨突觸(chu)(chu)傳播，與Cre依(yi)賴的(de)報告系統相結合(he)，可高效和(he)特(te)異(yi)性地驅動Cre依(yi)賴的(de)外(wai)源基因在(zai)突觸(chu)(chu)后神經(jing)元中(zhong)的(de)表達(da)，以標記(ji)突觸(chu)(chu)后神經(jing)元。2020年該研究(jiu)團(tuan)隊再次深入研究(jiu)了AAV1順(shun)向(xiang)(xiang)(xiang)跨突觸(chu)(chu)標記(ji)的(de)作用機制(zhi)——依(yi)賴于突觸(chu)(chu)囊泡的(de)釋(shi)放(fang)，同時揭示(shi)(shi)了其在(zai)多種神經(jing)環路中(zhong)的(de)廣泛應用，為(wei)(wei)AAV1作為(wei)(wei)順(shun)向(xiang)(xiang)(xiang)跨突觸(chu)(chu)示(shi)(shi)蹤病毒工具(ju)對(dui)神經(jing)元及其投射腦區進行(xing)標記(ji)提供(gong)了諸多證據(ju)，如圖5所示(shi)(shi)。

圖5、AAV1順向跨突觸標記 （Zingg B et al. J Neurosci, 2020）

可跨血腦屏障的血清型

血腦屏障的存在對中樞神經系統有很強的保護作用，但同時它也能阻隔藥物的傳遞和吸收，使神經系統疾病的治療變得異常困難，如圖6所示，AAV9 & AAVPHP.B& AAVPHP.eB& AAVPHP.S 可(ke)以有效介導基因(yin)由(you)外(wai)周(zhou)向(xiang)中樞神經(jing)系統的跨(kua)越(yue)，繼而將遺(yi)傳(chuan)物質遞送(song)至大腦或脊髓中。

圖6、可跨血腦屏障的血清型(Ken Y Chanet al, Nat Neurosci, 2017)

不知如何選擇血清型？用血清型篩選試劑盒！

雖(sui)然目(mu)前已經有(you)一(yi)(yi)些血清型(xing)表現(xian)出了(le)在(zai)中樞/外周神經系統中較強的(de)(de)(de)(de)特異性，但是(shi)仍然有(you)很(hen)多(duo)的(de)(de)(de)(de)待研(yan)細胞的(de)(de)(de)(de)合適血清型(xing)是(shi)未知的(de)(de)(de)(de)。為了(le)幫助(zhu)(zhu)各位研(yan)究人員篩選(xuan)到更(geng)合適的(de)(de)(de)(de)血清型(xing)，內含(han)多(duo)種(zhong)血清型(xing)的(de)(de)(de)(de)AAV篩選(xuan)試劑盒“應時而(er)生”，使(shi)用該“魔(mo)盒”只(zhi)需一(yi)(yi)次感染就(jiu)能檢測與驗證AAV血清型(xing)對靶組(zu)織的(de)(de)(de)(de)侵染特異性，進(jin)而(er)幫助(zhu)(zhu)受此困擾的(de)(de)(de)(de)研(yan)究人員快速篩選(xuan)到親(qin)嗜(shi)性更(geng)好(hao)的(de)(de)(de)(de)AAV血清型(xing)，以(yi)實(shi)現(xian)基因高效表達的(de)(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)(de)。

下圖為使用血清型篩選試劑盒檢測多種AAV血清型(xing)對小(xiao)鼠腦神(shen)(shen)經細胞的感染(ran)情況，從中(zhong)篩(shai)選出感染(ran)小(xiao)鼠大腦神(shen)(shen)經元細胞的更適血清型(xing)，如圖7所(suo)示(shi)，AAVPHP.EB較其他(ta)幾種血清型(xing)對小(xiao)鼠大腦神(shen)(shen)經元的侵染(ran)效率更高。

圖7、AAV血清型篩選試劑盒檢測多種AAV血清型對小鼠腦神經細胞的感染情況