你知道幾種動物細胞轉化常用方法？

將基因導(dao)入(ru)哺乳動物細胞的方法有(you)多(duo)種，效(xiao)率也不盡相同，可(ke)根據具體情況選(xuan)擇應用。 這里介紹幾種常用的方法：

1. 磷酸鈣沉淀法

該轉(zhuan)(zhuan)化(hua)方(fang)法(fa)(fa)是動物細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)中經典而又簡單(dan)的(de)方(fang)法(fa)(fa)。具體(ti)(ti)做法(fa)(fa)大致是∶將(jiang)待轉(zhuan)(zhuan)化(hua)的(de) DNA溶(rong)解(jie)在(zai)(zai)磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶(rong)液混勻，形(xing)成磷酸鈣微結晶與(yu)DNA的(de)共沉(chen)淀物，滴入細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)皿中，37℃保(bao)溫4~16 h，磷酸鈣晶體(ti)(ti)局部溶(rong)解(jie)膜結構，DNA便可(ke)(ke)以進入受(shou)體(ti)(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)核(he)，并整合到宿主(zhu)染色體(ti)(ti)上；棄去 DNA溶(rong)液，加入新(xin)鮮(xian)培(pei)養(yang)基，繼續(xu)培(pei)養(yang)7天即可(ke)(ke)篩選(xuan)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)株。在(zai)(zai)外源DNA中摻入少(shao)量的(de)受(shou)體(ti)(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內源性DNA，可(ke)(ke)以提高轉(zhuan)(zhuan)化(hua)效率。這種方(fang)法(fa)(fa)多數用(yong)于(yu)單(dan)層(ceng)培(pei)養(yang)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，也可(ke)(ke)用(yong)于(yu)懸浮培(pei)養(yang)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。

磷酸鈣沉(chen)淀法具有操作簡便、成本低(di)廉、可(ke)大批量轉(zhuan)染、對細胞毒性較(jiao)小、效果穩定(ding)等優點。但其轉(zhuan)染效率較(jiao)低(di)，對較(jiao)長（>20kb）的(de)DNA片段效果更差，應用甘油或DMSO對受體(ti)細胞進行休克，轉(zhuan)染效率會得到一定(ding)程(cheng)度提高(gao)。

2. 脂質體介導感染法

這種(zhong)方法(fa)即(ji)用(yong)脂(zhi)質體(ti)(ti)包埋核酸分子，然后將其導(dao)入細(xi)胞(bao)。脂(zhi)質體(ti)(ti)是一種(zhong)人工構建的(de)磷脂(zhi)雙分子層膜(mo)，用(yong)于轉移DNA較理(li)想的(de)膜(mo)成分是帶負電(dian)荷的(de)磷脂(zhi)酰絲(si)氨(an)酸。利用(yong)該方法(fa)曾(ceng)將外源基(ji)因成功地導(dao)入了(le)小鼠的(de)淋巴(ba)細(xi)胞(bao)和HeLa細(xi)胞(bao)。

脂(zhi)質體介導法(fa)的(de)(de)優點(dian)是效果穩定(ding)、感染效率高（比磷酸鈣沉淀(dian)法(fa)高5~100倍）；其(qi)缺點(dian)是成本較高、對外(wai)源基因長度有一(yi)定(ding)限(xian)制、細(xi)(xi)胞內積累的(de)(de)脂(zhi)類對細(xi)(xi)胞有一(yi)定(ding)的(de)(de)毒性。

3. 顯微注射法

顯微注(zhu)射法是創(chuang)造轉基(ji)因動物的(de)有(you)效途徑(jing)。其技(ji)術關鍵如下(xia)：①外(wai)源基(ji)因的(de)制(zhi)備(bei)；②收集受精卵；③顯微注(zhu)射；④受精卵移植。

顯微(wei)注射法的(de)(de)優點(dian)是：①此(ci)法可(ke)(ke)(ke)向任何(he)類型細(xi)胞(bao)導入外(wai)源(yuan)基(ji)因，甚至可(ke)(ke)(ke)向受(shou)精卵或(huo)早期(qi)胚胎中(zhong)導入外(wai)源(yuan)基(ji)因；②DNA用量極少，每個細(xi)胞(bao)僅需10-11 ml的(de)(de)注射體積(ji)；③注入細(xi)胞(bao)的(de)(de)DNA分子數可(ke)(ke)(ke)加以控(kong)制；④外(wai)源(yuan)DNA整合到宿主細(xi)胞(bao)染(ran)色體組中(zhong)的(de)(de)效率可(ke)(ke)(ke)達50%～100%，獲得穩(wen)定轉化系的(de)(de)比例也可(ke)(ke)(ke)達20%。此(ci)法的(de)(de)缺點(dian)是其(qi)設備要(yao)求離，且很昂貴。

4. 病毒感染法

通過病毒(du)(du)感染的方式將外源(yuan)基(ji)因(yin)導(dao)入(ru)動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)內，是一種常(chang)用(yong)的轉基(ji)因(yin)方法(fa)，例如(ru)現在(zai)常(chang)用(yong)的腺病毒(du)(du)、慢病毒(du)(du)和AAV等。這(zhe)種方法(fa)具有(you)定(ding)向性好(hao)、實驗重復(fu)性佳、導(dao)入(ru)效率高等優點。但也存在(zai)一定(ding)的缺陷(xian)，如(ru)目(mu)前常(chang)用(yong)的載體宿主范圍有(you)限，往往無法(fa)感染一些具有(you)重要經濟價值的家(jia)禽和牲畜細(xi)胞(bao)等。

5. 電擊法

將待轉(zhuan)化(hua)的DNA溶解于受體細(xi)胞(bao)(bao)懸(xuan)浮(fu)液中，然后加入電(dian)擊轉(zhuan)化(hua)儀的樣(yang)品槽內，兩端施加瞬(shun)時高壓電(dian)場，使細(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)產生細(xi)小的縫隙，此(ci)時DNA片(pian)段便可不(bu)經過胞(bao)(bao)飲作(zuo)用(yong)直接進入受體細(xi)胞(bao)(bao)。電(dian)擊法常(chang)用(yong)于對磷酸鈣共沉淀(dian)法無(wu)效的細(xi)胞(bao)(bao)類型，如(ru)生長在懸(xuan)浮(fu)液中的淋巴細(xi)胞(bao)(bao)等(deng)。

6.血影細胞介導法

血影(ying)細(xi)胞(bao)是指哺乳動物的(de)(de)(de)紅(hong)細(xi)胞(bao)在外(wai)(wai)部壓力(li)環境下(xia)發生(sheng)溶血，血紅(hong)蛋白(bai)大(da)(da)量(liang)溢出，最后(hou)形成僅(jin)被細(xi)胞(bao)膜(mo)包裹的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)結(jie)構。在溶血過程中(zhong)，紅(hong)細(xi)胞(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)通透性大(da)(da)增，在血紅(hong)蛋白(bai)溢出的(de)(de)(de)同時，外(wai)(wai)源(yuan)DNA也容易進入(ru)(ru)。當上述(shu)外(wai)(wai)界條(tiao)(tiao)件消失(shi)后(hou)，紅(hong)細(xi)胞(bao)膜(mo)又可恢復(fu)原來(lai)的(de)(de)(de)通透性。因此，可先將(jiang)外(wai)(wai)源(yuan)DNA轉入(ru)(ru)血影(ying)細(xi)胞(bao)，然后(hou)再將(jiang)血影(ying)細(xi)胞(bao)與受體細(xi)胞(bao)在適(shi)當條(tiao)(tiao)件下(xia)發生(sheng)細(xi)胞(bao)融(rong)合(he)，從(cong)而(er)將(jiang)外(wai)(wai)源(yuan)DNA轉入(ru)(ru)受體細(xi)胞(bao)。