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重組腺病毒的制備和使用

1. 重組腺病毒的制備

1.1 細胞轉染（以轉染 6孔板為例）

① 250μl DMEM和9μl PEI配成Mix1，靜置5min以上。

 ② 250μl DMEM和1μg穿梭質粒、2μg包裝質粒（即腺病毒骨架質粒），配成Mix2。

 ③ 將Mix1和Mix2混合，渦旋振蕩混勻，瞬離后，靜置30min以上，以便有充足的時間形成DNA-PEI復合物。

④ 靜置期間鋪6孔板HEK293細胞，細胞數約0.3-0.5×10⁶個/孔（也可提前鋪板）。

⑤ 將靜置后的混合液逐滴加入至6孔板細胞中。十字混勻后置于CO₂培養箱中培養。

1.2 擴增、收毒步驟

① 轉染后約14天，將六孔板中有CPE的細胞連同培養基吹下加入至10cm dish，混勻后置于 CO₂培養箱中培養。

 ② 收集有CPE的10cm dish細胞，用電動移液器轉移至 15mL離心管中，并做好相應的標記；

 ③ 3500rpm,離心7min；離心完成后，取出離心管，保留細胞沉淀，并將上清保存至其他離心管中備用。

 ④ 在細胞沉淀中加入腺病毒凍存液，用移液槍不斷地吹打沉淀，保證完全回溶，吸到1.5mL EP管中。

⑤ -80℃及 37℃反復凍融四次。

⑥ 凍融完成后，12000g離心2min。

⑦ 將上清用1mL槍移到二維碼管中，存放于-80℃的冰箱中。

1.3 大量擴增及收毒步驟

① 將收集起來的病毒上清平均滴加到10個10cm dish中，混勻后置于CO₂培養箱中培養，2-3天后收毒；

 ② 收集有CPE的10個10cm dish細胞，用電動移液器轉移至50ml離心管中，并做好相應的標記；

③ 3500rpm,離心7min，分別收集上清和細胞沉淀；

 ④ 病毒上清加入PEG8000和NaCl，混勻后4℃直立放置過夜；細胞沉淀置于-80℃保存備用。

1.4 純化前的處理

① 病毒上清處理

a. 第二天將4℃過夜的上清離心，3500g，4℃，離心 30min；

b. 離心后棄掉上清，收集病毒沉淀；

c. 用2mL凍存液將病毒沉淀重懸，收集到15ml管中備用。

② 細胞沉淀處理

a. 細胞沉淀用6mL腺病毒凍存液重懸，混勻，反復凍融四次；

b. 凍融完畢后，3500g，4℃，離心30min，分別收集上清和沉淀（細胞碎片）；

c.上清與重懸后的病毒沉淀混合；細胞碎片用2mL凍存液進行重懸；

③ 超聲波破碎細胞

a. 重懸后的細胞碎片超聲波破碎3-4次，至液體不粘稠；

b. 超聲完畢后，將液體分裝到2個EP管中，12000g，4℃離心10min；

c. 離心完成后，與病毒上清和細胞沉淀處理后的樣品混合。

1.5 純化與濃縮

① 純化——碘克沙醇密度梯度離心。

a. 配制不同濃度的碘克沙醇；

b. 取一個超離管，用電動移液器逐層、緩慢加入不同濃度的碘克沙醇；

c. 將處理好的病毒液加入到最上層；

 d. 超速離心，48000rpm，2h30min。離心前應將對應的超離管配平，誤差控制在0.1g以內。

② 濃縮

a. 離心完畢后，將超離管底用針頭刺破，收集腺病毒所在層至15mL管中；

b. 將收集的病毒液用凍存緩沖液稀釋至體積15mL，然后用0.2μm的濾膜過濾；

 c. 將過濾后的液體置于一個15mL的超濾管中，3500g離心50min進行濃縮，一般離心2-3次后達到預定體積；

d. 將超濾管中剩下的液體反復吹打后吸至病毒儲存管中，標明名稱和日期。

e. 將收集起來的病毒渦旋震蕩混勻后離心，吸10μL病毒液進行滴度檢測。

1.6 病毒滴度檢測

 實時定量PCR法是一種簡單的、高通量的測定病毒粗提裂解液和純化病毒樣本中腺病毒顆粒數量的方法。每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數的對數存在線性關系，利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。

① 去除游離DNA分子

 先將病毒稀釋10倍，以保證樣品中游離的DNA充分降解：取5μl病毒至45μl PBS緩沖液中，充分混勻。按以下體系配制Mixture：

37℃ 孵育30 min，95℃加熱5min使DNA酶失活。

② 去除病毒蛋白外殼

向上述體系中再加入 1μl蛋白酶K（5μg/μl）。37℃ 孵育30 min；再加30ul超純水稀釋至40ul（至此病毒原液稀釋100倍），95℃加熱5 min使蛋白酶K失活，然后12000rpm，離心2min，取上清進行qPCR檢測。

 ③ qPCR 將步驟2得到的上清，取5μl進行10倍梯度稀釋，即病毒原液稀釋了1000倍。分別取2μl待測樣品及標準品作為模板進行qPCR檢測。

qPCR反應體系如下：

qPCR反應程序：

④ 數據分析

病毒顆粒數的計算：病毒顆粒數(VP/mL) =與標準品相對值×1000

2. 重組腺病毒的使用

2.1 腺病毒體外感染細胞

① 腺病毒感染目的細胞預實驗

 不同細胞系細胞表面的腺病毒受體數量不同，這就決定了不同細胞系所使用的MOI會有所不同。通常，易感染細胞系所使用的MOI范圍為10-100。 但是，對于某些難感染的細胞系，MOI可能需要高達1000。對于大多數細胞系來說，最佳MOI的范圍很窄。我們建議您查閱文獻或者在正式實驗前，在目的細胞中用報告基因的腺病毒進行預實驗摸最佳MOI。

為了節省病毒，推薦使用96孔板進行預實驗。操作步驟如下：

a. 第一天細胞的準備

 將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%較佳。為保證細胞生長良好，請保證細 胞貼壁過夜。

b. 第二天病毒的稀釋

取 10μL腺病毒原液加入90μL培養液中做1:10稀釋（10^-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10^-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。

c. 第二天感染目的細胞

 取出提前準備好的96孔板，用準備好的病毒稀釋液替代舊培養液，注意保留未加入病毒的 細胞孔作為對照組。

d. 第二至四天觀察熒光或檢測

 腺病毒對細胞的感染較快，請在感染細胞后12、24、36、48小時分別觀察細胞中熒光表達 情況（如果您選擇的產品不帶有熒光標簽，請在 48、72、96、120小時分別收獲細胞并通 過 Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達）。

② 腺病毒感染目的細胞實驗

 進行腺病毒感染實驗時可使用完全培養液（培養目的細胞用）稀釋。培養液中的血清、雙抗或其他營養因子不會影響腺病毒的感染效率。 以 24孔培養板為例，進行HEK293細胞的感染實驗操作步驟如下：

最適病毒用量的計算公式： 病毒用量pfu=最佳MOI×細胞數目/病毒滴度

例如,如果您目的細胞的最佳MOI=10，您需要感染10⁶的細胞，那么您共計需要107pfu的病毒.如果病毒滴度為1×10¹⁰ pfu/mL,那么您實驗需要的病毒量就是1ul.

a. 第一天細胞的準備

在24孔培養板接種若干孔，每個孔內接種3-5×10⁴個 HEK 293細胞，鋪板時細胞的融合率為50%左右，每孔培養液體積為300μL(進行病毒感染時細胞的匯合度約為70% )。

b. 第二天病毒的準備

 根據實驗的實際情況和MOI值，用培養液準確稀釋腺病毒原液。 注意事項：可使用 PBS緩沖液或無血清培養液稀釋病毒原液。

c. 第二天感染目的細胞

在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液，混勻后放于CO₂培養箱（37℃、 5% CO₂）孵育過夜。

d. 第三天更換培養液 病毒感染細胞12小時后，更換培養液。

e. 第三天感染效率檢測

 感染 24小時后，可利用倒置熒光顯微鏡觀察病毒感染目的細胞的效率。如選擇的腺病毒載 體不帶有熒光標記，可以通過Q-PCR(定量PCR)檢測目的基因的表達來評估感染效率。

基因過表達

基因沉默

基因編輯